（一）抗原制备

Ig是免疫球蛋白，对异种动物而言，是良好的抗原物质。可以刺激异种动物产生抗Ig血清，经适当提取后，产生抗Ig抗体，又叫第二抗体或抗抗体。在多数的间接标记反应中，均需制备抗Ig抗体。

（二）材料与试剂

1.提取的动物Ig

2.弗氏*佐剂和弗氏不*佐剂

3.和

4.实验动物 兔

5.其它材料及试剂

（三）操作方法

1.免疫方法 可以采用以下各种方法之一进行免疫。

（1）淋巴结注射法：①在兔的两后足跖部皮下（或皮内）注射活卡介苗50mg（每侧约0.30ml）。7～10天后，兔跖及腘肌淋巴结肿大;②于肿大的两侧淋巴结内各注射加有*佐剂的IgG乳化抗原0.50ml（含IgG 5mg/ml、1 000U/ml、1 000μg/ml）;③必要时，14天后，重复步骤②一次;④再过7天后，于两侧淋巴结内各注射加有*佐剂的IgG乳化抗原0.50ml（含IgG5mg/ml、1 000U/ml、1 000μg/ml）;⑤5～7天后，耳静脉采血。测定血清效价。

（2）皮下多点注射法：①家兔两侧掌（跖内各注射含有*佐剂抗原0.10ml（IgG含量5mg/ml）;②7～10天后，脊柱两侧多点（颈、胸、腰椎各两点、共6点）皮下注射含不*佐剂的抗原，每点0.50ml;③7～10天后，脊柱两侧重复注射一次;④7～10天后试血。不合格者重复步骤③。

（3）多途径联合注射法：①两侧掌（跖）内侧皮下注射含*佐剂抗原0.50ml（IgG量为5mg/ml）;②14天后，多点皮下注射含有不*佐剂抗原;③7天后，耳静脉注射不含佐剂的抗原2ml;④测定血清抗体效价，不合格者重复步骤③，并适当递增IgG量。

2.效价测定 采用琼脂扩散法。

（1）将血清倍比稀释，加入外周孔。

（2） 中间孔加动物Ig。

（3） 37℃湿盒琼扩24小时，观察结果。

（四）结果判定

1.抗Ig的效价测定 琼脂扩散效价达1﹕16或1﹕32者为合格。

2.纯度鉴定 采用琼扩法。中间孔加抗Ig血清，外周孔加Ig和标准品Ig。在抗Ig与Ig以及标准品Ig均出现一条沉淀线，且这两条沉淀线相互融合者，说明提取的Ig是纯的。