PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段,即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下:
PCR循环过程中有三种不同的事件发生:(1)模板变性;(2)引物退火;(3)热稳定dna聚合酶进行DNA合成。
1. 变性:加热使模板DNA在高温下(94-95℃)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变性阶段。
2. 退火:在体系温度降至37-65℃,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,使引物与模板链3’端结合,形成部分双链DNA,即退火阶段。
3. 延伸:体系反应温度升至中温72℃,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按5’到3’方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环,即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲,每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。
琼脂糖凝胶电泳的原理:琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,沸水中溶解,45℃开始形成多孔性刚性滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。不同DNA,其分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA,主要是利用分子筛效应,迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭(EB)为扁平状分子,在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物,其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上,且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察,可检测到5 ng以上的DNA。
三、实验材料及相关试剂
基因组DNA,基因特异性引物,PCR扩增相关试剂,等
四、实验步骤
1.模板DNA的抽提:实验一所得的水稻基因组DNA。
2.PCR操作 (在冰上操作):
(1)PCR反应混合液的配制:反应体系25 µL, 在无菌的0.2 mL离心管中按下列操作程序加样:
(2)将反应混合液混匀, 然后每个PCR管中分装24 µL反应混合液,再加1 µL模板DNA,zui后加1滴石蜡油,防止水分蒸发, 然后稍离心。
(3)将PCR管放到PCR热循环仪中,按下列程序开始循环: