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士锋RNA的电泳,转膜和杂交
点击次数:1243 更新时间:2014-05-07

实验原理:基本同Southern Blotting,但因RNA是单链分子,必须消除局部区域形成的二级结构,在电场中泳动的距离才能反映它本身的大小,因而需使用变性胶进行电泳;操作过程中应特别注意防止RNA的降解。 
实验材料:经检测质量好的RNA样品 
实验步骤: 
1.制胶: 
Agarose 1%-1.2%,1×MOPS buffer。 
用灭菌的DEPC水定容,加热融化,冷却至70℃加甲醛,使终浓度为2%,通风橱中放1hr。 
2.准备电泳液:1×MOPS buffer(小号槽约配500ml,中号槽约配900ml) 
3.制样:测好浓度后按以下体系加样 
15 mg RNA + 灭菌的DEPC水 10 ml 
Sample buffer 8 ml 
loADIng buffer 2 ml 
EB (10mg/ml,于RNA) 0.03 ml 
65℃水浴变性10 min,立即放冰上,直至点样 
4.点样:点样要仔细,不要漏出,并记录点样顺序。 
5.电泳:中号槽: 电压100V电泳1hr左右,至溴酚兰离点样孔约3.5-4cm(凝胶在紫外灯下可看到28S和18S刚好分开即可) 
6.转膜:转膜液用500ml 4×SSC加27ml 37%甲醛(终浓度为2%);转膜步骤同Southern。注意加溶液后一切操作均在通风橱内进行,以避免甲醛对人体的伤害 
7.照相:将胶及膜取下,分别在凝胶成像系统下看胶上RNA是否有残留,膜上RNA效果是否完好。 
8.风干:在超净工作台上吹干。 
9.固定:于紫外交联仪内以1200 ENERGY照一次约半分钟,再重复一次,再在超净工作台上吹干。 
10.杂交:在杂交管内加约50ml杂交液,将膜卷起放入,注意RNA面朝内,于64℃预杂交1-4hr 
11.探针准备:预先挖胶回收的PCR产物或酶切产物(better),测浓度,跑胶验证后,按以下体系加入 
DNA 3 ml(约200ng) 
ddH2O 10 ml 
DNTP(1.67mM) 4 ml 
杂交Buffer 10 ml 
Klenow Fragment 2 ml 
α-dCTP* 5 ml 
先加入DNA 和 ddH2O,100℃变性10min,冰上放5min,再加入DNTP和杂交 primer,加酶时注意低温操作,先加在管壁上,立即到同位素室加同位素,混匀离心,于室温下反应半小时。 
12.探针纯化:在原反应体系中继续加入 
ddH2O 66 ml 
NaAc 10 ml 
无水乙醇 250 ml 
混匀离心12000rpm 5min,倒去上清后加500 ml无水乙醇洗,离心 2 min,12000 rpm,倒去上清,检测信号,达103-104较好,加40 ml ddH2O和400 ml杂交液之后混匀离心,于100℃变性10min,冰上放置5min 
13.13探针:取出杂交管倒去杂交液,加入15ml杂交液,将探针加入,盖紧,于64℃杂交过夜 
14.洗膜,压片:将杂交管中液体倒出,先加少量洗膜液Ⅰ,冷洗5min,倒出,再多加些洗膜液Ⅰ,冷洗10min,将膜取出测信号,根据信号大小决定是否热洗,若信号高,用洗膜液Ⅱ,Ⅲ继续洗,直到信号值达到适宜值为止,即膜上某一区域信号强,而其他区域信号弱代表杂交上了,然后包膜压片,放于-20℃或-80℃3天左右即可洗X片。 
15.结果观察与分析 

 
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