目的

对于许多重组DNA的实验，知道DNA的序列常是进一步操作所*的。 本实验将定出你所选殖之cDNA的序列，并进行数据库比对分析。其目的在教导学生如何从事DNA定序分析及DNA序列的计算机分析。

原理

本实验所使用之方法为F. Sanger所发展之dideoxy定序法。 此法乃是将一引子黏合到欲定序之DNA模板上，再利用DNA聚合脢行聚合反应，直到加入一dideoxyribonucleoside triphosphate (ddNTP)而中断。 每一定序分析须执行四组反应，每一反应含有所有四种deoxyribonucleoside triphosphates (dNTP)及*之一种ddNTP。 由于ddNTP缺少核酸链聚合所需之3’-OH基，四组反应中的核酸链将会分别停在A、 G、 C或T。 dNTP和ddNTP的相对浓度可调整至所产生中断链的长度范围从数十到数百个核甘酸。然后，利用高解析力之定序胶体电泳将四组反应产生之dna片段依长度大小分开，即可读出DNA序列。

材料

• RNAse A：10 mg/ml水溶液。

• 30% polyethylene glycol (PEG) 6000/1.5 M NaCl

• 2 M NaOH/2 mM EDTA

• 3M sodium Acetate (pH 5.3)

• 下列试剂来自United States Biochemical公司所售之Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit：

o Sequenase Reaction Buffer (5X concentrate)：200 mM Tris-HCl (pH 7.5)，100 mM MgCl2，250 mM NaCl

o pUC/M13 forward (-47) primer： 5"-d(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)-3"

o 四种Termination Mix： 均含50 mM NaCl，80 ?M dATP，80 ?M dGTP，80 ?M dCTP，80 ?M dTTP，并各含8 ?M ddATP，ddGTP，ddCTP或ddTTP

o 0.1 M dithiothreitol(DTT)

o Labeling Mix (5X concentrate)： 7.5 ?M dGTP，7.5 ?M dCTP，7.5 ?M dTTP

o Enzyme Dilution Buffer：10 mM Tris-HCl (pH 7.5)，5 mM DTT，0.5 mg/ml BSA

o Sequenase Version 2.0 T7 DNA polymerase：13 units/?l in 20 mM KPO4 (pH7.4)，1 mM DTT，0.1 mM EDTA，50% glycerol

o Stop Solution： 95% formamide，20 mM EDTA，0.05% bromophenol blue，0.05% xylene cyanol FF

• 10 mCi/ml [35S]dATP：购自Amersham公司

• 40% acrylamide/bis-acrylamide(19:1)溶液

• urea

• 10X TBE buffer：890 Mm Tris-borate，890 mM boric acid，20 mM EDTA

• 10% ammonium persulfate

• TEMED (N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine)