一、试剂

1 、 10 × TBE ( pH 8.3 )：

2 、 46% 尿素溶液：

3 、 20% 聚丙烯酰胺溶液

4 、 10% 过硫酸胺

5 、引物

6 、模板

7 、 DNA 聚合酶

8 、放射性标记的 dNTP 和 ddNTP 贮存液

9、TEMED

二、操作方法

(一)由双链质粒制备单链DNA膜板

取质粒 DNA (溶于双离蒸去离子水中) 8μl ( 1.5 ～ 2ug )

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加 2mol NaOH 2ul ，混匀后稍加离心，置室温 10min

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加 3mol 乙酸钠( pH5.2 ) 3μl

双蒸去离子水 7μl

无水乙醇 60μl

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置液氮 10min ，离心 10min ( 13krpm )，

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加 70%乙醇洗1次，离心 ( 13krpm )

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弃上清，真空抽干，溶于 10ul双 蒸去离子水中

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取样，电泳鉴定

(二)聚丙烯酰胺/尿素胶制备：

将玻板洗净，拭干; 70% 乙醇洗，凉干;内层涂硅油，

重蒸水洗净，吹干

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混合： 20% 聚丙烯酰胺液 20ml

10 × TBE 5ml

46%尿素 25ml

总计40ml过滤纸滤过

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加 10%过硫酸胺(AP)250μl;用双蒸去离子水定容至100ml，混匀

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倒胶前加入 TEMED 50μl，混匀

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灌胶，待凝胶聚合后，将测序胶板安装于测序电泳槽中

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电泳槽中加入 800ml1 × TBE

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预电泳

(三)DNA序列反应：

模板 DNA 10μl ; 4 只离心管上标记

引物 2μl G 、 A 、 T 、 G 各管中

退火缓冲液 2μl 分别加入 2.5ul 的 ddNTP

总体积 14μl 终止混合液，盖好盖子。

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60℃ 10min 变性 37℃孵育1min

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标记混合物 3μl

α-32P-dATP 1μl

稀释的DNA聚合酶2μl

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混匀后置室温5min

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每个反应管4.5μl ↓

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37℃ 5min温浴

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每管加入5μl 终止液

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混匀，置冰上

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上样前75～80℃

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混匀，置冰上

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上样前75℃～85℃加热2min，随即上样

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依次为A、G、C、T，每孔上样2～3μl

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40W恒功率下电泳，至溴酚蓝走到底

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