甘油含量测试盒说明书
一、产品描述： 甘油是甘油三酯的水解产物。甘油三酯水解生成 1 分子甘油和 3 分子游离脂肪酸，称为脂肪分解。脂 蛋白酯酶水解血中甘油三酯；胰脂酶水解食物中的甘油三酯；激素敏感脂肪分解酶水解脂肪细胞中的甘油三 酯。与游离脂肪酸一样，甘油含量是甘油三酯水解反应的可靠检测指标，但检测更加方便。本试剂盒釆用甘 油磷酸氧化酶法与经典 GPO Trinder 酶学反应，通过比色测定液体样品甘油含量。试剂盒经过优化使得操作 简単，检测灵敏度 10umol/L,线性范围 10-1200 umol/L,可靠性和重复性俱佳。适合生物医学、食品实验 室检测。
二、测定原理： 在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化为 3-磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化产生过氧化氢，在过氧 化氢酶作用下生色底物转化为苯醍亚胺，光密度值与甘油浓度成正比。
三、 产品用途：测定血液、细胞培养基、体液、酒类饮料中的甘油。
四、试剂组成及配制：(100-500T) 试剂组成 规格 保存条件 R1 40 mlXl 瓶 本试剂盒 4°C 避光 保存，有效 期 3 个月 R2 10 mix 1 瓶 4mM 甘油标准品 1ml X 1 支 工作溶液的配制：按 R1：R2= 4:1 比例，即 4ml 试剂 R1 与 1ml 试剂 R2 混合，现用现配,用多少配多少 可供 300?500 次微板测定或 100 次 1 ml 比色杯测定。
五、所需设备： 酶标仪、(721、722 型)可见光分光光度计、生化分析仪。 工作波长 550nm,如无此波长建议优先选用 570、530、490nmo比色杯光径 1cm。
六、操作过程：
1、 样本处理 1 、酒精、饮品、清澈体液样本：直接测定，如超过线性范围用蒸馏水或生理盐水稀释后测定。 2 、培养液样本:取不含酚红无颜色无血清的细胞培养基液，如有细胞碎片应 4°C 条件下 12, 000g 离心 5min 清除，取上清测定。 3 、血液样本：新鲜抗凝血 4°C 2000g 5min 得到血浆，或非抗凝血 4°C 2 小时取血清。2000g 离心 l0min 除去血细胞。70°C l0min 灭活内源脂肪酶，再次 12, 000g l0niin, 取上清测定或-20 °C 保存。
2、 标准品稀释：用蒸馅水、生理盐水或与样品缓冲液一致的液体，将 4mM 甘油标准品倍比稀释为 1000、500、250、 125、62.5、31.25、15.625、7.8125 umol/L,通常 4—6 管即可，注意设置 0 浓度对照反应管。
3、甘油测定1 、参见下表加样。先加标准甘油或待测样品，后加工作溶液。甘油浓度很低时，可尝试样品 与工作液体积 100:100 ul 能否进一步增加灵敏度，但样品超过 100 ul 将稀释酶浓度而降低灵敏度。 超出线性范围可适当稀释，根据稀释倍数计算浓度。 2 、37°C 20min (15?30min)。或 25°C 室温 30min 但灵敏度略降。反应平衡后颜色在 60min 内稳定 3 、先用蒸馏水空白管调零，然后测定各管 0D 值。
4 、绘制标准曲线并计算甘油浓度。Excel 作图步骤：各标准管 0D 值为 y 轴，标准品浓度为 x 轴。(1)鼠标左键圈住数据，点击做图向导，选择-散点图-，点击-完成-o (2)鼠标右键 点图上的 某一点，点击-添加趋势线-，点击-选项-，点击显示公式-和-R2 值-。 表 1 酶标微板测定的加样比例(检测范围 10-1200 umol/L) (可微量调整样品与工作液体积比例) 培养基或低甘油浓度样品测定 高甘油浓度样品测定 空白管 标准管 测定管 空白管 标准管 测定管 蒸馄水/生理盐水 50ul 5ul 标准品 50ul 5ul 样品 50ul 5ul 工作溶液 150ul 150ul 150ul 195ul 195ul 195ul 表 2 1ml 比色杯测定的加样比例(检测范围 10-1200 umol/L) 培养基或低甘油浓度样品测定 高甘油浓度样品测定 空白管 标准管 测定管 空白管 标准管 测定管 蒸馅水/生理盐水 200ul 50ul 标准品 200ul 50ul 样品 200ul 50ul 工作溶液 600ul 600ul 600ul 750ul 750ul 750ul
七、 注意事项： 1、细胞培养须用不含酚红的无色无血清培养基。正常血清甘油浓度为 20?130umol/L。任何含血清 培养基需 *洗去。2、 试剂混浊或 550nm 处空白反应管吸光度大于 0. 2 时弃去。 3、 维生素 C＞0. 18g/L、血红蛋白＞2g/L、＞0.25g/L、还原剂二硫苏糖醇、疏基乙醇等干扰测试。
八、 参考文献： 1、 Trinder, P. (1969). Ann. Clin. Biochem. 6:24 - 27. 2、 Barham D and Trinder P. (1972). Analyst 97:142 - 145.
