仪器用具： 37℃培养箱及冰浴 Electroporation cuvette （electrode gap, 0.1 cm） Electroporator （Bio-Rad, IBI geneZapper 或其它厂牌） 药品试剂： 无菌水 （置冰浴中） 10% glycerol （置冰浴中） SOB 液体培养基 SOB 固体培养基 SOC 液体培养基 SOC/Amp 固体培养基 大肠杆菌JM109 Ligation mixtures 方法步骤： 菌体的处理： 1） 进行转形实验的前16~20 h,将菌种JM109 接种在SOB 固体培养基上，并在37℃培养箱中培养。 34 Methods in Biotechnology Vol 1 2） 取80 mL SOB培养基装入250 mL灭过菌的三角瓶。 另取1 mL SOB加于微量离心管中。由SOB固体培养基上选8 个约2~3 mm大小的单一菌落接入1mL SOB中，震荡将菌体打散后，加入80 mL SOB中，于37℃震荡培养约2~3h,直至细胞数约为4~7×107/mL. 3） 收集菌液于离心管中，置冰浴中10 min. 4） 以750~1,000 g 离心12~15 min （4℃）。 5） 倒去上清，并尽量将液体倒干，或以微量移液器头吸干净。 6） 沉淀加入80 mL 冰冷的无菌水，稍加震荡，混合均匀后以750~1,000 g 离心12~15 min （4℃）。 7） 倒去上清，菌体再依序以40 mL 及1.6 mL 无菌水同法处理。 8） 菌体以0.16 mL 冰冷的10% glycerol 悬浊。 9） 菌液每80 μL分装一管，可直接用于electroporation,或以液态氮或干冰快速冻结后置 -70℃贮存。 Electroporation: 1） 进行electroporation 的DNA 样品溶液中离子强度不可过高，DNA 需先经过透析或以酒精沉淀处理。透析可如2.3.1 节步骤15） 进行。 2） Cuvettes 自包装中取出后，置冰浴中至少5 min. 3） 将菌液置于冰浴中，加入DNA 样品，混合后，小心将溶液吸至cuvette 的凹槽中，将cuvette 置冰浴中。 4） 进行electroporation 时，将cuvette 由冰浴中取出，将四周水份擦干，置于反应槽中，并接上电极线。 5） 以2.5 kV, 21 μF 进行electroporation. ◆ 注意!高电压! 6） 取出cuvette，立即加入1 mL SOC. 7） 吸出菌液移至微量离心管中，于37℃震荡培养45 min. 8） 取200 μL 菌液涂布于SOC/Amp plate.置37℃培养16~20 h. 9） 观察plate 上菌落的形状并计算菌落数。
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