用Langendorff灌流消化（胶原酶II）只能取得心肌细胞。建议直接将心脏剪碎，成纤维细胞我们这里一般采用0.05％消化。无菌条件取出心脏D-hank's液（PBS也可）漂洗，剪碎心脏加入5倍体积消化液，37C水浴3－5min，反复吹打，静置，待自然沉降后弃去上清液。剩余沉淀再加入约5倍体积0.08%及0.1%胶原酶II混合液，反复吹打，大约10分钟（消化时间往往靠经验的判断），离心取沉淀重悬于含20％BSA的DMEM（有条件可以用Cascade的培养液）。60－90min后更换培养液（差速贴壁，成纤维细胞比心肌细胞贴壁快）。 1、的作用比较强烈，联合使用胶原酶将胶原纤维充分消化后利于离心时细胞沉淀，提高细胞存活率。另外，消化时间不宜太长，主要凭观察和经验来判断。离心采用1000rpm 5min。 2、酶的配置可以用d-Hank's液或生理盐水都行。血清的作用主要是终止消化，用一般加了血清的DMEM就行，我们这里是20％胎牛血清。 3、贴壁时间：我师兄曾经告诉我2hr，现在我觉得90min已经很好了。 4、细胞可以先用台盼蓝测定存活率。 5、鉴定：在倒置显微镜下观察，细胞呈梭形、多角形，细胞质透明，细胞核大，呈椭圆形，常含有2－3 个核。IHC可以用I抗体（动物抗人B3、抗波形蛋白、抗血管平滑肌肌动蛋白）其余基本按IHC的步骤来 |
