细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。 一、冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 二、慢冻程序 1、标准程序：采用细胞冻存器 当温度在-25 ℃以上时， 1~2 ℃/min； 当温度达-25 ℃以下时， 5~10 ℃/min； 当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中。 2、简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1~2 ℃的速度，在40 min内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。 3、传统程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30 分钟→ -80℃ 16~18 小时（或隔夜） → 液氮槽储存。 三、低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 四、细胞冻存方法 1、预先配制冻存液 10%DMSO + 细胞生长液（20%血清+基础培养液） 10%甘油+ 细胞生长液（20%血清+基础培养液） 2、取对数生细胞，经消化后，加入适量冻存液， 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ~ 5 ×106细胞/ml） 3、加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。液氮保存 五、保存细胞的复苏方法 1、快速解冻 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。 2、解冻后的细胞可直接接种到含*生长培养液的细胞培养瓶中直接进行培养，24小时后再用新鲜*培养液替换旧培养液，以去除DMSO。 3、如果细胞对冷冻保护剂特别敏感 解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含*生长培养液的培养瓶中。 |
