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小鼠乳腺上皮细胞培养

点击次数:794 发布时间:2015/1/29
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实验材料:

1.  10-12周龄妊娠小鼠乳腺组织

2.  不含Ca 2+ 和Mg 2+ 的1×PBS,添加200000IU/L、200mg/L和200000U/L,pH7.4

3.  FBS、含5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS液或DMEM

4.  0.05%Ⅰ型胶原酶50ml、0.05%蛋白酶50ml、0.1%DNaseⅠ型、结晶紫(0.1%)/枸橼酸(0.1mol/L)

5.  培养液:血清培养液(DMEM或F12+10%FBS)、无血清培养基(DMEM:F12为1:1,加胰岛素1-5μg/ml、转铁蛋白10μg/ml、BSA1-5mg/ml等)。胶原凝胶铺底液(酸性胶原液或自制鼠尾胶原,10×F12,用缓冲液稀释)

6.  分化培养基:为DMEM/F12按1:1(体积比)比例配制的混合培养基,添加5μg/ml胰岛素、1μg/ml、3μg/ml催乳素和50μg/ml。其中,催乳素以3μg/ml浓度溶于10mmol/L NaOH中,过滤除菌,4℃下可保存2周,使用前添加到培养基中。

7.  C溶液:为9.6μg/ml的Dispase溶液,用DMEM配制。

8.  、解剖剪、解剖镊、眼科剪,

9.  离心管(15ml、50ml)、10cm塑料培养皿、300ml有盖的三角烧瓶(2个,处理胶原酶及蛋白酶用)、高压灭菌的带尼龙网(孔径150μm)的烧杯

10.  厚胶原胶的制备:以8:1:1(体积比)的比例配制鼠尾胶原、F12与NaHCO 3 /NaOH的混合液作为包被液。包被液的组分包括鼠尾胶原液、10×浓度的F12、0.26mol/L NaHCO 3 和0.125 mol/L NaOH混合液。分别除菌。将包被液和培养板在4℃下预冷。然后,按150μl/cm 2 的用量加到培养器皿内。置37℃下1h,用培养液洗2次(每次30min),然后加入血清-胎球蛋白混合液。

 

实验方法:

1.  麻醉处死小鼠,75%乙醇消毒,置于蜡板上,用大头钉固定四肢。用正中线剪开皮肤,用镊子引开皮肤,用大头针固定在板上。切下约5g乳腺脂肪组织,放入装有PBS液的平皿内洗涤3次。

2.  用刀片反复切割、或用剪刀剪碎乳腺至糊状。然后将组织碎块移至三角烧瓶内,加50ml胶原酶,置37℃恒温水浴中水平振荡1-2h(100-200次/min)。

3.  当无大片组织块时,用尼龙网将细胞滤至烧杯内,以除去未消化的组织。滤液移至5ml离心管内,1000r/min离心约3min,去上清,加PBS液2ml在手中振摇使细胞团大散,移入装有50ml胶原酶的三角烧瓶内,这时会见部分细胞悬液中出现云雾状,经10-15min后会消失。放入37℃恒温水浴中缓慢水平振摇30min(30次/min)。

4.  加10%血清或BSA约5ml,同上法用尼龙网过滤,以1000r/min离心约1min。向细胞团中直接加血清或BSA约1ml,拍击离心管,打散细胞团(此时细胞脆弱,一般不进行吹打)。移至10ml离心管中,加5mlPBS液混匀,以1000r/min离心约1min,洗涤细胞3次,可除去成纤维细胞和红细胞。

5.  zui后向细胞团中加血清或BSA,打散细胞团,加5-10mlPBS液吹打10次左右,使其成为均一的细胞悬液,计数细胞数。用此法分离的细胞多呈块状,很难正确计数,必要时用0.1ml细胞悬液加0.9ml结晶紫,剧烈振摇细胞约1min,此时细胞易破坏而使胞核着色,可计数蓝染细胞核数。每克组织约可收货5×10 6 —10×10 6 个细胞。

6.  得到的细胞用含10%FBS的DMEM或无血清培养液悬浮,将上述消化的乳腺上皮细胞以密度为1.0×10 5 —2.5×10 5 个/cm 2 将其接种在厚胶原胶膜包被的培养板上,加入细胞分化培养基进行培养。

7.  培养72h,待细胞融合后,用移液器吸头或细胞刮刷将胶原膜与培养板底面分离,使胶原膜收缩并漂浮在培养基中,之后每2-3d更换一次培养液。

8.  细胞传代。消化溶液为10×-EDTA混合消化液,在37℃下孵育7min。另外,使用溶液作为消化液。操作如下:原代细胞培养后,用DMEM培养基洗培养板,再用1/4稀释液(2.4μg/ml)的中性蛋白液洗培养板2次。加入100μl/cm 2 的Dispase溶液,于37℃静置20min。再加入5%胎牛血清的DMEM/F12培养液以终止消化。

9.  再用含5%胎牛血清的DMEM/F12离心洗涤沉淀细胞(250r/min,4min)。离心后用5%胎牛血清的DMEM/F12培养液重新悬浮细胞。

10.  将细胞悬液以1.0×10 5 —2.5×10 5 个/cm 2 的细胞密度接种,培养在生长培养基中。如果用于分化培养,接种24-48h后可更换为分化培养基。

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