碱性磷酸酶钙―钴法

   磷酸 酶(phosphatase)是水解磷酸酯酶的总称。磷酸酶不仅参与磷酸酯化合物的水解反应。而且也参与其逆反应及磷酸转移反应。

    1．碱性磷酸酶  碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)在碱性环境下可催化各种酚和醇的磷酸酯水解，还具有磷酸转移作用，在细胞膜上运输作用较为活跃，如肾近端小管的刷状缘、小肠上皮的微绒毛、肝脏的胆小管、毛细血管内皮细胞及神经元的突触膜均可显示此酶活性。

    在碱性环境(；pH 9．2～9．4)中，碱性磷酸酶将磷酸盐的底物(如β-，α-萘酚磷酸钠)分解，产生的磷酸离子被孵育液中的钙离子捕获生成磷酸钙沉淀。因磷酸钙不能显色，需加入硝酸钴，用钴离子置换钙离子，形成磷酸钴沉淀后用硫化铵处理，形成棕黑色硫化钴颗粒沉淀，从而显示酶活性部位，硫化钻沉淀的多少与碱性磷酸酶含量成正比，其反应通式

碱性磷酸酶钙-钴法反应原理

1)孵育液配制

    2％氯化钙          20ml

    2％钠        10ml

    3％β    10ml

    5％          5ml

    蒸馏水             5ml

    孵育液zui终pH 9．4,置于冰箱内保存。

    2)染色程序：①新鲜组织恒冷箱切片(可用10％福尔马林固定10分钟，或不固定)；②人孵育液，37C~孵育10分钟(肾)至 60分钟(肝)；③流水冲洗；分钟；④人2％硝酸钴溶液2分钟；⑤蒸馏水浸洗；⑥人1％硫化铵溶液内1分钟；⑦蒸馏水洗；⑧甘油明胶封固。

    3)结果与评价：酶 活性部位显示棕黑色为硫化钴沉淀。该法的反应产物可发生扩散，定位欠准确，应加以注意。

    4)对照实验：加入抑制剂L四咪唑等结果为阴性；去底物(孵育液中用10ml蒸馏水代替底物)结果为阴性。