准备工作：
细菌培养：小量提取质粒dna鉴定正确后，将菌液以1/50~1/20体积的比例接种到250ml液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长晚期。
注：培养体积与zui终质粒DNA的收获量并无线性关系。只要培养条件适宜，50ml的培养液有时也可得到总量高达1mg以上的质粒。 操作步骤：
1、细菌的收获：将菌液倒入合适的离心管中，8000g离心5分钟，弃上清，并在吸水纸上倒置离心管使上清全部流尽。 2、将细菌沉淀重悬于10ml溶液Ｉ中。
溶液Ｉ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris•Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)
注：（1）若溶液Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ配制时间过久，可加入少量；（2）由于沉淀的影响，悬液的体积会达到11~13ml。 3、加15ml溶液Ⅱ，颠倒混匀。
溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS 4、加12ml溶液Ⅲ，轻微振荡混匀。
溶液Ⅲ：5mol/Ｌ乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml 5、12000g离心5分种，弃沉淀。将上清转移到另一离心管中。 6、加入60%体积的异丙醇，颠倒混匀后，室温静置5分钟。12000g离心５分钟，弃上清。 7、沉淀溶解于4~6mlTE中，加入1/50体积RNaseA贮存液，颠倒混匀，37℃静置10分钟。 8、加入1/2体积的Tris饱和酚、1/2体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液，剧烈振荡混匀。 9、4℃12000g离心30秒，将上层液体与少量下层液体转移到另一离心管后，再12000g离心5分种，小心吸取上层液体。 10、加入等体积13％聚乙二醇(PEG8000)-1.6mol/LNaCl混合液，颠倒混匀，冰上静置0.5~2小时。 11、4℃12000g离心10分种，弃上清，DNA沉淀用70%乙醇洗涤。 12、沉淀干燥后，溶解于适量高压灭菌的水中。
注：（1）溶解体积一般为0.2~1ml；（2）此时得到的是已经纯化的质粒DNA，可直接进行各种酶学操作。 13、取样品进行电泳或紫外定量。 |
