引物设计原则： 1。长度 一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即taq酶的zui适温度 2。碱基分布的均衡性 同一碱基连续出现不应超过5个 GC含量一般40-60% GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性 GC含量太高也易于引发非特异扩增。 3。引物Tm值 一般要求：55℃-65℃。 计算： 对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算 对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“zui近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件zui常用的计算方式。 Tm = △H/(△ S + R * ln (C/4)) + 16.6 log ([K+]/(1 + 0.7 [K+])) - 273.15 4。引物二级结构 引物二聚体 尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补发夹结构尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响dna聚合酶的延伸。 5。引物3’端 引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增*失败。考虑到密码子的简并性，引物3’端zui后一个碱基不与密码子第三个碱基配对。 6。引物5’端 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列(酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基)。 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。 5’端标记放射性元素或非放射性物质(如、)。 6。引物的内部稳定性 过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3’端为G或C。 现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结构，而3’端在碱基配对的情况下为低稳定性结构，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C。仅仅3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的，如果3’端为富含G、C的结构，只需3’端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。 7。引物的保守性与特异性 保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别 特异性：避免非特异性扩增 |
