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士锋生物质粒DNA介绍
点击次数:1318 更新时间:2013-09-26

一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤:培养细菌,使质粒DNA大量扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多,其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法和羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株的类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途选择不同的方法。本实验介绍zui常用的碱裂解法和煮沸法提取质粒DNA

1. 碱变性法
碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离的目的。在pH值高达12.6的碱性环境中,染色体的线性DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而被变性;共价闭环质粒DNA的大部分氢键也断裂,但两条互补链不会*分离,仍会紧密地结合在一起。用pH4.8KAcNaAc高盐缓冲液调节其pH值到中性时,因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起,因此可以迅速复性;而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已*分开,不能复性,它们相互缠绕形成不溶性网状物,而复性的质粒DNA恢复原来构型,保持可溶性状态。通过离心,染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去,用酚-氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA,然后用乙醇或异丙醇将溶于上清液中的质粒DNA沉淀。

2.煮沸法
细胞用含有TritonX100的缓冲液处理,溶解细胞膜。用酶解细菌细胞,然后在高温条件下,使细胞裂解,破坏细菌细胞壁,有助于解开DNA链的碱基对,并使蛋白质和染色体DNA变性。而闭环质粒DNA配对虽被破坏,但双链彼此不分开,当温度下降时恢复成超螺旋。变性蛋白带着染色体DNA一起沉淀下来,质粒DNA仍留在上清液中。离心后的上清液再用异丙醇或乙醇处理,沉淀出质粒DNA

以上两种制备方法的实验过程中,由于细菌裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用,染色体DNA容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒DNA共同存在,因此,采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有质粒DNA外,还可能有少部分染色体DNARNA,必要时可进一步纯化。
提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA一般并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等,因此不必除去。

【试剂与器材】

(一)菌种和培养基
1.
大肠杆菌DH5α(含质粒pT-GFP,该质粒为T载体联上了绿色荧光蛋白GFP基因的重组质粒)。
2.LB
液体培养基(Luria-Bertani) :称取蛋白胨(Tryptone)10 g,酵母提取物(Yeast extract) 5 gNaCl 10 g,溶于800mL去离子水中,用NaOHpH7.2,加去离子水至总体积1L。分装于150 mL三角瓶中,每瓶50 mL,置高压蒸气锅以1.034×105Pa121℃灭菌20分钟。
3.
氨苄(Ampicillin, Amp)母液:用无菌水配成 10 mg/mL水溶液,过滤除菌,分装成小份存于灭菌有盖离心管中,-20℃保存备用,不宜反复冻溶。

(二)试剂
1.
溶液I50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)10mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌15min,储存于4℃冰箱。
2.
溶液0.2 mol/L NaOH(临用前用10mol/L NaOH母液稀释),1 SDS(从10% SDS母液中稀释,SDS母液可室温保存),现配现用。
3.
溶液III5 mol/L KAc 60mL,冰醋酸11.5mLH2O 28.5mL,高压灭菌,4℃冰箱保存。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L
4.3 mol/L
醋酸钠 (pH5.2)800 mL水中溶解408.1g NaAc•3H2O,用冰醋酸调pH5.2,加水定容至100mL,分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。
5.STE
缓冲液:0.1mol/L NaCl10mmol/L Tris•Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA (pH8.0)
6.STET
0.1 mol/L NaCl10mmol/L Tris•Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA (pH8.0) 5% Triton
X-100

7.TE
缓冲液:10 mmo/L Tris•Cl (pH8.0)1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。
8.RNA
A母液:将RNAA溶于10mmol/L Tris•Cl(pH7.5)15mmol/L NaCl中,配成10mg/mL的溶液,于100℃加热15min,使残留的DNA酶失活。冷却后用1.5mL Eppendorf管分装成小份保存于-20℃
9.
10mg/ml):用10mmol/L Tris.Cl, PH8.0, 新鲜配制。
10.TE
饱和酚(1
11.
:氯仿:异戊醇 (25:24:1)
12.
氯仿:异戊醇(24:1):按氯仿:异戊醇=24:1体积比加入异戊醇(2)。氯仿可使蛋白变性并有助于水相与有机相的分开,异戊醇则可消除抽提过程中出现的泡沫。
13.
电泳所用试剂: (1 TBE 缓冲液 (5×):称取 Tris 54g,硼酸27.5g,并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20mL,定溶至1000mL。 (2)上样缓冲液 (6×)0.25% 溴酚蓝,40% (w/v) 蔗糖水溶液。
14.
异丙醇
15.70
%乙醇

(二)设备
超净工作台,微量取液器(20μL, 200μL, 1000μL),台式高速离心机,恒温振荡摇床,高压蒸汽消毒器灭菌锅,涡旋振荡器,电泳仪,琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。

【操作方法】

(一)小量制备
碱变性法:
1.
将含有质粒pGFPuv DH5α菌种划线接种在LB固体培养基(含有100 μg/mL Amp)(3)上,37℃培养12-24小时(4)。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mL LB液体培养基含有100 μg/mL Amp)中,37℃振荡培养14~16小时。
2.
1.5 mL培养液加入1.5 mL 离心管中,室温12, 000 r/min离心1分钟收集菌体视菌体量多少,可重复此步
3.
加入100 μL预冷的溶液涡旋振荡悬浮菌体(5)。
4.
加入新配制的溶液Ⅱ200μL,轻缓上下颠倒离心5次,至溶液澄清千万不要振荡,冰浴5分钟(6)。
5.
立即加入用冰预冷的150μL溶液III,轻柔振荡5~10次(7),冰浴5分钟(8),12, 000 r/min离心5min
6.
取上清移入干净Eppendorf管中,加入等体积的酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1),剧烈振荡20秒。室温下12,000 r/min离心10分钟,可见溶液分三层,上层为质粒DNA溶液,中层为变性的蛋白层,下层为有机相。
7.
取上清(6),加入400μL氯仿:异戊醇(24:1),剧烈振荡20秒。12,000r/min 离心10分钟。(选做)
8.
取上清,加入2~2.5倍体积无水乙醇振荡混匀,沉淀DNA-20℃放置10min7)。(或者加1倍异丙醇,室温静置10min),12,000rpm 离心10分钟。
9.
去上清,加入200μL 70%乙醇(8),12000g2分钟。洗涤沉淀两次以去盐。
10.
Eppendorf管倒置于一张纸巾上,使液体流出,然后短暂离心,用移液器小心取出残液,这一步操作要格外小心,有时沉淀块贴壁不紧,放离心管于超净工作台蒸发痕迹乙醇。(除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连,轻缓抽吸,并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时,尽可能使吸头远离核酸沉淀,然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴)。
11.
将沉淀溶于30μL TE缓冲液(pH8.0,含20μg /mL RNaseA)中(9),储于-20℃冰箱中。如直接酶切,可将沉淀溶于30~50μL ddH2O(含20μg /mL RNaseA)。
12.
利用比色法测定质粒DNA260 nm280 nm下的光吸收值并计算样品浓度。
13.
1%琼脂糖凝胶电泳观察质粒DNA的纯度和条带情况。


煮沸法
1.
1.5ml 培养菌体(1)置于离心管中,10000g离心1分钟。
2.
弃上清(2),将管倒置于卫生纸上几分钟,使液体流尽。
3.
将菌体沉淀悬浮于350ul STET 溶液中, 涡旋混匀。
4.
加入25ul 新配制的溶液(10mg/ml) 3, 涡旋振荡3 秒钟混匀。(溶液PH值不能低于8.0,否则就不能有效发挥作用。)
5.
将离心管放入沸水浴中,时间恰为40秒,12000g,离心10分钟。
6.
吸出上清移至另一个离心管,或直接用消毒牙签取出沉淀物,在上清中加入40ul 5mol/L NaAcPH5.2)和420ul 异丙醇,振荡混匀,室温放置5分钟。
7.12000g
4℃离心5分钟,将Eppendorf管倒置于一张纸巾上,使液体流出,然后短暂离心,用移液器小心取出残液,这一步操作要格外小心,有时沉淀块贴壁不紧,放离心管于超净工作台蒸发痕迹乙醇或室温直至乙醇挥发殆尽,管内无可见的液体(25)分钟。
8.
弃上清, 加入1ml70%乙醇,12000g4℃离心2分钟。按步骤7回收核酸沉淀。
9.
加入50ul TEPH8.0)(含无DNA酶的RNA 20ug/ml),溶解DNA,稍加振荡,储存于-20℃


(二)大量制备
碱变性法:
1.
从平板上挑选一个单菌落,接种到50mL培养基,37℃夜培养14~16小时。
2.
将培养物转入50mL离心管,4,800r/min 4℃离心10分钟。
3.
沉淀用10mL STE洗涤,涡旋打匀, 4,800r/min 4℃离心10分钟。
4.
加入3mL溶液I,涡旋,冰浴5分钟。
5.
加入6mL溶液Ⅱ(现配,轻柔颠倒数次直至溶液澄清,保持冰浴5分钟。
6.
马上加入溶液Ⅲ 4.5mL,轻柔颠倒5~10次,得到白色沉淀,冰浴35分钟。
7.4,800r/min 4℃
离心20分钟,取上清,加入0.6倍体积异丙醇,室温放置10分钟,沉淀DNA
8.4,800r/min
室温离心 10分钟,去上清,加入75%乙醇,洗涤沉淀。
9.4,800r/min
离心 10分钟,去上清,吸出痕量剩余乙醇,风干。
10.
加入1.5mL TE溶液,溶解沉淀,转入7mL离心管。
11.
加入等体积5mol/L LiCl (预冷,颠倒混匀,冰浴10分钟,沉淀大分子RNA
12.10,000r/min 4℃
离心10分钟,取上清,加入等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置10分钟。
13.10,000r/min
室温离心10分钟,室温放置20~30分钟。用700μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml )的TE(pH8.0)溶解沉淀
14.
转移至1.5mL离心管,加入等体积13% PEG8000/1.6mol/L NaCl,混匀,冰浴10分钟,沉淀双螺旋质粒DNA
15.12,000r/min
离心10分钟,去上清,加入1mL 75%乙醇,洗涤沉淀。
16.12,000r/min
离心10分钟,去上清,吸出痕量剩余乙醇,风干。
17.
加入600μL TE溶液溶解沉淀。
18.
酚、酚:氯仿:异戊醇、氯仿:异戊醇各抽提一次,去除蛋白。
19.
将上清转移至另一离心管,加入1/10体积3M NaAc2倍体积无水乙醇,4℃沉淀10分钟。
20.12,000r/min
离心10分钟,去上清,加入1mL 75%乙醇,洗涤沉淀。
21.12,000r/min
离心10分钟,去上清,吸出痕量剩余乙醇,风干。
22.
加入200μL ddH2O,溶解质粒。

(三)聚乙二醇沉淀法质粒DNA
这里介绍的方法(R.Tresman,个人通讯)已卓有成效地用于纯化碱裂解法制备的质粒DNA。
1)将核酸溶液[上页步骤22)所得]转入15mlorex 管中,再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液,充分混匀,用Sorvall SS34 转头(或与其相当的转头)于4下以10 000/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA。
2)将上清转移到另一30mlCorex管内,加等量的异丙醇, 充分混匀,用SorvallSS34转头(或与其相当的转尖)于室温以10 000/分离心10分钏, 回收沉淀的核酸。
3)小心去掉上清,敞开管口,将管倒置以使zui后残留的液滴流尽。于室温用70%乙醇洗涤沉淀及管壁,流尽乙醇,用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴,敞开管口并将管侄置,在纸巾上放置几分钟,以使zui后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。
4)用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml )的TE(pH8.0)溶解沉淀,将溶液转到一微量离心管中,于室温放置30分钟。
5)加500μl13%(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的1.6mol/L NaCl,充分混合,用微量离心机于412000g离心5分钟,以回收质粒DNA。
6)吸出上清,用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚:氯仿、氯仿各抽1次。
7)将水相转到另一微量离心管中,加100μl 10mol/L乙醇铵,充分混匀,加2倍体积(约1ml)乙醇,于室温放置10分钟,于412 000g离心5分钟,以回收沉淀的质粒DNA。
8)吸去上清,加200μl处于412 000g离心2分钟。
9)吸去上清,敞开管口,将管置于实验桌上直到zui后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。
10
)用500μlTE(pH8.0)溶解沉淀1:100稀释[用TE(pH8.0)] 后测量OD260,计算质粒DNA的浓度(1OD26050μg质粒DNA/ml), 然后将DNA贮于-20℃

【注意事项与提示】

(一)小量制备
1.
碱变性法注意事项
1)市售酚中含有醌等氧化物,这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNADNA的交联,应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1%的8-羟基喹啉作为抗氧化剂,并用等体积的0.5mol/L Tris•Cl (pH8.0)0.1mol/L Tris•Cl(pH8.0) 缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上,因为酸性条件下DNA会分配于有机相。
2)氯仿可使蛋白变性并有助于水相与有机相的分开,异戊醇则可消除抽提过程中出现的泡沫。
3)培养时应加入筛选压力(抗生素),否则菌体易污染,质粒易丢失;
4)使用处于对数期的新鲜菌体(老化菌体导致开环质粒增加),细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解,培养时间不要超过16小时;
5)溶液I中各成分的作用:葡萄糖的作用是分散细胞,EDTACaMg等二价金属离子的螯合剂,其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性。
6)溶液加入后5min内快速用溶液III中和,防止共价闭和环状质粒DNA在强碱环境中暴露时间过长发生不可逆的变性,质粒易被打断;溶液II中各成分的作用:NaOH主要是为了溶解细胞,释放DNA,因为在强碱性的情况下,细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的变化;但NaOH易和空气中的CO2发生反应形成NaCO3,降低了NaOH的碱性,所以必须用新鲜的NaOHSDSNaOH联用,其目的是为了增强NaOH的强碱性,同时SDS能很好地结合蛋白,产生沉淀。
7)加入溶液II III后不要剧烈振荡,防止可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中;
8)复性时间也不宜过长,否则会有基因组DNA的污染;
9)酚:氯仿:异戊醇抽提后,应小心吸取含质粒DNA的上清溶液,防止吸到位于有机相和水相之间的变性的蛋白质,约可吸到420μL
10)使用冰乙醇沉淀DNA,并在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀更*。
11)沉淀后应用70%的乙醇洗涤,以除去盐离子等;
12TE中的EDTA能螯和Mg2+Mn2+离子,抑制DNase活性,pH值为8.0,可防止DNA发生酸解;
13)溶液III 中各成分的作用:溶液III 中的KAC是为了使钾离子置换 SDS 中的纳离子而形成了 PDS,因为十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 (potassium dodecylsulfate,PDS),而 PDS 是不溶水的,同时一个 SDS 分子平均结合两个氨基酸,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。2 M 的醋酸是为了中和 NaOH,因为长时间的碱性条件会打断 DNA,所以要中和。基因组 DNA 一旦发生断裂,就不能再被 PDS 共沉淀了,所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡,不然zui后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入,琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase
得到的质粒样品一般用含RNase50 ug/ml)的TE缓冲液进行溶解,不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时,多数情况下你能看到三条带即超螺旋、线性和开环这三条带。

2. 煮沸法注意事项
1)从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株(endA+株,如HB101 )制备质粒时,建议不使用煮沸法。因为煮沸步骤不能*灭活内切核酸酶A,以后在Mg2+存在下温育时,质粒DNA可被降解。 用70%乙醇洗涤一步前增加用酚:氯仿进行抽提步骤,可避免此问题。
2)的细菌沉淀和核酸沉淀中去除上清液时,一定要除尽。否则质粒DNA不能被限制酶切割。
3)添加有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。

(二)聚乙二醇沉淀法质粒DNA常见问题及可能原因

1.
提取的质粒DNA不纯:变性不充分;关键步骤反应时间过短;离心时间或速度不够。
2.
提取的质粒DNA呈涂布状:操作过程中用力过猛,动作过大;操作系统内有污染。
3.
与染色体DNA分离不全:变性过程不*;试剂配制有问题(成分,浓度或pH)。

【实验安排】

1.*天:
上午:配制所需的各种试剂及培养基,装好枪头、离心管、牙签等耗材,并在高温下灭菌。
下午:接种摇菌

2.第二天:
上午:收取培养物,提取质粒DNA
下午:比色和电泳检测DNA的浓度和纯度以备酶切

【实验报告要求与思考题】

1.提交质粒DNA的浓度结果及电泳检测图谱
2.
质粒的基本性质有哪些?
3.
碱法提取DNA的过程中溶液生化作用原理分别是什么?
4.
在碱法提取质粒DNA操作过程中应注意哪些问题?
提质粒流程图:

 

 

 
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