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士锋生物总RNA抽提试剂盒使用原理介绍
点击次数:856 更新时间:2013-11-13

[实验原理]

Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总rna的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性,裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

无论是人、动物、植物还是细菌组织,各种样品zui大使用量(1ml Trizol),动物组织( 50mg),植物组织(100 mg),丝状真菌( 100mg),动物细胞(5×106~1×107),酵母(1×107) 。

TRIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。例如,从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色,可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带,(mRNA和hnRNA成分)两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S),低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8 。

[实验用品]

【实验耗材】

1、移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl。酒精擦拭,头部重点,紫外线照射。

2、吸头:1ml、200μl、20μl

3、匀浆管:5ml

4、吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个

5、EP管:1.5ml、0.2ml、100μl

6、试剂瓶:2个60ml的棕色广口试剂瓶。小瓶(分装无水乙醇,高压的DEPC水,-20°C保存)。

7、量筒:50ml、250ml、500ml

8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml

9、试管架:5ml、1.5ml、20μl

10、盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC水

11、铝制饭盒:4个

12、塑料小饭盒:1个

13、大瓷缸:2个

14、锡泊纸:一卷

15、卷纸:2卷

16、三角烧瓶:带盖,稍大(融琼脂糖)

【实验仪器】

天平、振荡器、高速离心机、0.5~10ul、20~200ul、100~1000ul加样器。

【自备试剂】

DEPC(焦碳酸二乙酯),氯仿,异丙醇,无水乙醇,0.05~0.1%DEPC-H2O,75%乙醇,TE缓冲液,琼脂糖。

RNA抽提的准备工作

【试剂配制】

1.DEPC水: 1ml+1000ml双蒸水=1‰ DEPC水,1000ml容量瓶中静置4小时。

2.75%乙醇:无水乙醇+DEPC水,-20℃保存(DEPC水需先高压)

3.氯仿:棕色瓶

4.异丙醇:棕色瓶

【器具处理与准备】

1.塑料制品:(包括枪头、EP管、匀浆管等)

先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,小枪头需打入DEPC水,室温过夜,高压,烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管)。胶塞同样处理。塑料器皿也可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟,用水*漂洗干净后高压灭菌备用。

2.玻璃制品:

泡酸过夜,冲洗干净,1 ‰DEPC过夜,蒙锡纸,150°C烘烤4h,180°C,2h。或泡酸过夜,冲洗干净后高温烘烤,1 ‰DEPC过夜,高压。盛装乙醇,DEPC水用。

3.匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡DEPC)

[实验内容和方法]

一、抽提

(一)组织抽提

1.组织取材后用灭菌的锡箔纸包好保存于液氮。实验时,在液氮中将组织研磨成粉末,趁液氮未挥发将粉末转移到EP管,室温5000rpm离心去上清。每50-100mg组织,加入1ml Trizol。

2.若是新鲜标本经匀浆后转移离心管,加入1ml Trizol。

3.若组织量(1~10 mg)或细胞数很少(102~104),在样品中加入800 ul Trizol反复抽吸均匀,再加入糖原(终250ug/ml),剧烈振荡或用匀浆器匀浆。

4.在匀化后和加入氯仿之前,样品可以在–60~70°C保存至少一个月。

(二)细胞抽提

1.倒掉培养基,PBS洗,直接将1ml Trizol 注入培养瓶(5×106),反复抽吸均匀。

2.或收集细胞后加入Trizol 反复抽吸均匀。

二、分相

3.在装有裂解物的离心管中加入0.2ml的氯仿(为Trizol总体积的1/5),振荡混均30秒,室温下静置5分钟.

4. 12000 rpm 15分钟4°C,分相为三层。上层:RNA(约为Trizol的60%);中间:DNA;下层:蛋白质(酚-氯仿)。

5.小心吸取上清液,转移到另一EP管中。1ml裂解物产生的上清液体积约为0.4~0.6 ml。有机相和中间层含有DNA和蛋白质,避免触及。

三、RNA沉淀

6.上清液加入约0.5ml的异丙醇,振荡混均30秒。室温下静置10分钟。

7.离心12000rpm 10分钟4°C。

8. RNA沉淀将在离心底的侧面形成。小心吸弃上清液,注意避免吸弃RNA沉淀。

四、RNA清洗

9.离心管加入1ml 预冷的75%乙醇(1mlTrizol至少1ml乙醇清洗DNA),振荡混均30秒,使沉淀振荡起来,室温12000rpm×1~2分钟。(有文献称不超过7500g离心)。尽可能吸弃上清液,防止RNA沉淀丢失。重复以上清洗步骤一次。在75%乙醇中,RNA在4℃至少保存1周,-20℃至少保存1年。

10.室温选择流动性小,倒置离心管于滤纸上,干燥RNA,但不能*干燥(5~10分钟)。用DEPC水15μl溶解沉淀,55-60℃孵育10~15分钟。

11.测量OD值后,样品放置-70℃保存,一个月

五、RNA、DNA浓度的计算

取78μl DEPC水加2μl 第10步液体,则稀释倍数为40倍。

【RNA】=A260 X 40 X n/1000μg/μl

【DNA】=A260 X 50 X n/1000μg/μl(n为稀释倍数)

分离RNA的理想效果是A260/A280=1.8~2.0

A260代表RNA OD值;A280代表蛋白OD值

[注意事项]

1. RNA产量:每1 mg组织或1×106培养细胞预期的RNA产量

(1)肝和脾,6—10μg

(2)肾,3—4μg

(3)骨骼肌和脑组织,1—1.5μg

(4)胎盘,1-4μg

(5)上皮细胞(1×106 ,8—15μg cultured cells)

(6)纤维母细胞(1×106 ,5—7μg cultured cells)

2.电泳检测: 制备甲醛变性,1%琼脂糖凝胶快速电泳,25ug/lane,65V,2.5h,检测RNA分子完整性,观察18S、28S条带。

3. RNA沉淀*干燥,会地降低可溶性。部分溶解的RNA其A260/280比值<1.6。用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5% SDS溶解RNA,并在55~60°C下孵育10分钟,当RNA以后要用于酶切反应时,避免使用SDS。

对于胰腺,肾等组织中RNase含量很高,沉淀用去离子甲酰胺溶解,–70°C保存。

4.分离RNA的理想效果是A260/A280=1.8~2.0

【分离胶范围】<500bp 1.2~1.5%

>10 kp 0.3~0.7%

二者之间 0.8~1.0%

【分析和定量】紫外分光光度计测定A260及A280来定量分析RNA的纯度及浓度。用什么稀释的RNA,就用其调零。

5.预防RNA酶污染

6.在分相步骤吸取上清液过程中,和清洗步骤吸弃上清液过程中,都应在不触及其他相或沉淀的前提下吸取尽可能多的上清液。

7.台式离心机zui大能达到2,600×g的离心力,如果将离心时间延长到30-60分钟可以满足操作。

8.当TRIZOL用量少于2ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。TRIZOL用量较大时,可以使用玻璃试管(Corex)或聚丙材质试管,事先检验以确保该试管可以耐受加入TRIZOL和氯仿后12,000×g的离心力。不可使用有裂缝或者破损的试管。 离心前小心平衡试管。离心前玻璃管口必须盖上铝箔并用石蜡膜封口,聚丙烯管必须盖紧。

9. 用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。

【疑难解答】

一、无RNA沉淀

1. 匀浆不*:匀浆不*时,基因组DNA分子仍然很大,溶液粘稠。变性的蛋白质和基因组DNA一起形成絮状凝集物容易包裹RNA,使之不能有效地释放到溶液中。

2..沉淀不*:从小于2×105动/植物细胞、小于2mg动物组织、小于4mg

植物组织或RNA含量低的动/植物组织中提取RNA时,匀浆体积太大,将造成RNA过分稀释而不能沉淀下来。当从这样的样品中提取RNA时,应按比例减少抽提溶液。

二、抽提率低

1. 系统超负荷:如果过多增加单位体积内的样品量,将引起系统超负荷。系统超负荷常导致匀浆不*、单位体积内的DNA和蛋白质所占比例增大,使RNA不能有效地释放到上清中。系统超负荷还会导致相分离困难,降低RNA沉淀效率.

2.样品均化或裂解不*: 匀浆不*时,RNA分子易被蛋白质和基因组DNA复合物包裹,不能被有效释放。

3.终RNA不*溶解:未溶解的RNA丢失。

4.样品未及时处理或细胞生长过度:样品分离后短时间内细胞内RNA酶被激活,细胞生长过度同样会激活细胞内RNA酶,若不及时提取RNA,大部分RNA会被降解。若样品暂时不作RNA提取,应立即用液氮冷冻*,置-80℃贮存。

三、A260/A280 比率 <1.65

1.在分光光度计测量前用水而不是用TE 缓冲液稀释RNA样品。低离子强度和低pH溶液会增加280 nm处的光吸收值。

2.样品匀浆化时所加的TRIZOL量太少。

3.匀浆化后样品没有在室温下放置5分钟。

4.分离的水样层中污染有层。

5.终RNA没有*溶解。

四、RNA降解

1.从动物体取下的组织没有立即进行抽提或冰冻保存。

2.用于抽提的样品,或抽提的RNA样品保存于–5—–20°C,而不是存放于–70°C。

3.细胞经消化而分散。

4.水溶液或试管污染有RNA酶。

5.用于琼脂糖凝胶电泳的福尔马林pH低于3.5。

6. RNA在水溶液中呈酸性,易自发水解,应溶于TE,-20℃以下保存。?

五、DNA污染

1.样品匀浆化时所加的TRIZOL量太少。

2.用于抽提的样品包含有机溶媒(如乙醇,DMSO),强缓冲液或碱性溶液。

六、蛋白多糖和多糖污染

下述的对RNA沉淀方法改进能从抽提的RNA中移去复合污染。以匀浆化时每1 ml TRIZOL为例,在水样层中加入0.25 ml异丙醇后再加入0.25 ml的高盐溶液(0.8 M柠檬酸钠和1.2 M NaCl)。将终溶液混匀,离心并继续进行前述的抽提操作。改进后的沉淀法能有效地析出RNA而多糖和蛋白多糖仍以可溶的的形式留在溶液中。对于含有大量多糖的植物,要抽提其RNA将改进后的沉淀法和在zui初匀浆化时多加一次离心(RNA 抽提指南,可选方案)合并使用是十分必要的。

另外,关于实验所用的细胞,如果有新鲜的就用新鲜的,因为使用冻存过的细胞实验结果会比较差。如果没办法马上进行RNA提取实验,建议先加入抽提试剂将样品裂解之后在细胞冻存。

 
 
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