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士锋生物猪瘟单克隆抗体ELISA方法试验介绍
点击次数:548 更新时间:2014-01-02

(一)材料及试剂 
1.猪瘟单抗纯化抗原 
2.兔抗猪IgG酶标抗体 
3.猪瘟阳性血清 
4.猪瘟阴性血清 
1~4均由的生物制品所购买。 
5.elisa反应板 
6.包被液 
碳酸钠 1.50g 
2.93g 
H2O加至 1 000ml 
pH值9.6 
7.PBS液 
氯化钠 8.90g 
磷酸二氢钾 0.20g 
无水 2.13g 
加双馏水 1 000ml 
8.PBS-吐温洗涤液 
PBS液 1 000ml 
犊牛血清 5ml 
混合即可 
9.底物溶液 
⑴ 0.1Mol/L柠檬酸液 
柠檬酸 21g 
双蒸馏水加至 1 000ml 
⑵ 0.2Mol/L Na2HPO4液 
Na2HPO4·12H2O 71.6g 
双蒸馏水 加至 1 000ml 
⑶ pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液 
取⑴液 24.30ml 
⑵液 25.70ml 
混匀即可 
⑷邻苯二胺液 
取⑶液 50ml 
双馏水 50ml 
磷苯二胺 20mg 
30%H2O2 0.15ml 
待邻苯二胺溶化后再加H2O2,现用现配。 
10.终止液 
浓H2SO4(98%) 22.2ml 
H2O 177.80ml 
(二)操作方法 
1.用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各做100倍稀释,每孔包被100µl,4℃湿盒过夜。 
2.次日取出,甩去孔内液体,3×3′冲洗。 
3.将待检血清以PBS液做400倍稀释,每孔加100µl同时将猪瘟阳性血清、猪瘟阴性血清各做100倍稀释,于对照孔中加100μl。37℃温育1.5h~2h。 
4.重复第二步,取出,甩去孔内液体,3×3′洗涤。 
5.将兔抗猪IgG酶标抗体以PBS液做100倍稀释,每孔加100μl,37℃温育1.5h~2h。 
6.重复第4步。 
7.每孔加底物溶液100µl,室温下观察显色反应。当阴性对照孔稍显色时,立即终止反应,并以阴性孔做空白对照。 
8.每孔加终止液50µl立即于酶联免疫吸附检测仪测定490nm波长的光密度。 
(三)结果判定 
在猪瘟弱毒酶联板上,OD≥0.2,为猪瘟弱毒抗体阳性;OD<0.2,为猪瘟弱毒抗体阴性。 
在猪瘟强毒酶联板上,OD≥0.5,为猪瘟强毒抗体阳性;OD<0.2,为猪瘟强毒抗体阴性。

 
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