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士锋生物谷类作物种子中赖氨酸含量的测定
点击次数:1226 更新时间:2014-03-07

蛋白质中赖氨酸(lysine,Lys)的含量是谷物品质的主要指标之一。由于动物及人类不能合成,须从食物中得以补充,为此培育高含量赖氨酸的谷物,对于提高营养价值有重要意义。本实验分别用茚三酮溶液显色法和染料结合法(Dye Binding Lysine,DBL)测玉米种子中赖氨酸含量。

一、茚三酮显色法原理: 谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的ε-NH2,它与茚三酮(ninhydrin)试剂可发生颜色反应,生成紫红色物质,其颜色与赖氨酸残基的数目成正相关。选用碳原子数目与赖氨酸相同的,配成标准溶液,做出标准曲线,可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量. 

二、材料、仪器设备 
(一)材料:不同品种的玉米种子,用粉碎机粉碎,过100目筛子,收集过筛后的细粉,放入广口瓶内,加入沸程60~90℃的石油醚,使其淹过粉面,浸泡8h,不时搅动进行脱脂。然后过滤,并用石油醚淋洗沉淀若干次,弃去滤液。将脱脂玉米粉晾在干净的滤纸上,置阴凉通风处吹干石油醚。收集干粉,置干燥器内,保存备用。 
(二)仪器设备:1. 722型分光光度计;2. 水浴锅;3. 试管;4. 圆头玻璃棒(圆头大小要与试管大小配套)。 
(三)试剂:1. 缓冲溶液,称取30g甲酸钠,溶解于约60ml蒸馏水中,加入10ml8%的甲酸,zui后加水到100ml;2.茚三酮试剂,称取1g茚三酮和1g氯化镉(CdCl2.H2O),加入25ml上述缓冲溶液和75ml乙二醇,室温下放置一天,第二天使用。若出现沉淀,则过滤后使用。该溶液一定要头一天配制,第二天使用,不宜放置过久,也不能现用现配;3.4%和2%溶液各50ml;4.标准溶液,准确称取25mg,加数滴,待溶解后定容至50ml,该溶液亮氨浓度为500μg/ml。准确吸取上述母液1,3,5,7,9ml,分别稀释至25ml,待用。

三、实验步骤
(一)绘制标准曲线准确吸取已配好的标准浓度系列的溶液各0.5ml,分别放入5支试管中,每种浓度做三个重复。再取一支试管加入0.5ml蒸馏水做空白对照。向每支试管中各加入0.5ml的4%碳酸钠溶液和2ml茚三酮试剂(头一天配好的),混匀,在80℃恒温水浴上保温30min。取出后,立即放入冷水浴中冷却3min,然后向每管内加入5ml的95%乙醇,摇匀,在分光光度计上500nm波长处进行比色,以空白做对照,读取吸光度。以吸光度值为纵座标,浓度为横座标,绘出标准曲线,并求出曲线的斜率。 
(二)样品的测准确称取已脱脂的各种玉米种子干粉各25ml,每个品种做三个重复。放入试管中(试管应预先烘干),加入约300mg细石英砂(估计数字)和1ml2%碳酸钠溶液,用圆头玻棒充分搅拌2min,注意切勿将试管挤破,将试管放入80℃恒温水浴中,提取10min,应常搅动。取出试管,向每管内按顺序加入2ml茚三酮试剂,混匀,放入80℃恒温水浴中,保温显色30min,同时以蒸馏水做一空白对照,取出后,立即放入冷水浴中冷却3min,以下步骤与标准曲线做法相同。加完乙醇后进行过滤,用滤液进行比色,读取吸光度。若样品颜色过深,则可取一定量的滤液用95%乙醇稀释后比色,吸光度的数值以在标准曲线范围内为宜。在标准曲线上查出相当的含量。一般作物的籽粒中,蛋白质含量约为干重的10%~20%,富含蛋白的种子中则为30%~50%;赖氨酸含量约为3~7g/16g氮。

四、结果计算按下列公式进行计算: 
赖氨酸含量(μg Lys/mg)=G×2×N/W 。式中:G—为标准曲线上查出的的量(μg/0.5ml);N—为样品稀释倍数;W—为样品的重量(mg)。

 
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