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士锋生物免疫电泳实验技术
点击次数:884 更新时间:2014-04-21

(一)原理 免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上行电泳,使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开,然后加入抗体做双相免疫扩散,把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇,在二者比例适当的地方,形成肉眼可见的沉淀弧。该方法可以用来研究:①抗原和抗体的相对应性;②测定样品的各成分以及它们的电泳迁移率;③根据蛋白质的电泳迁移率,免疫特性及其它特性,可以确定该复合物中含有某种蛋白质;④鉴定抗原或抗体的纯度。
(二)试剂与器材同琼脂平板电泳。
(三)操作方法 1.在玻璃板的放置一小玻棒(d=2mm~3mm),然后用0.05mol/L pH8.6缓冲液配制1%琼脂,制成琼脂板,板厚2mm.。 2.在玻棒的两侧,板或1/3处,距玻棒4mm~8mm各打直径3mm~6mm的孔。 3.在孔内加满血清。 4.将玻璃板置电泳槽上进行电泳。电流为2mA/cm~3mA/cm(或电压3V/cm~6V/cm),电泳时间4h~6h。 5.停止电泳,用小刀片在玻璃板两侧切开,取出玻璃棒,加抗血清样品。 6.于湿盒内37℃(或常温)扩散24h,取出观察。7.于生理盐水中浸泡24h,中间换液数次,取出后,加0.05%氨基黑染色5min~10min,然后以1mol/L冰醋酸脱色至背景无色为止。8.制膜、观察、保存标本。
(四)免疫电泳结果分析 1.常见的沉淀弧 由于经电泳已分离的各抗原成分在琼脂中呈放射状扩散,而相应的抗体呈直线扩散,因此生成的沉淀一般多呈弧形,常见的弧形如下:①交叉弧:表示两个抗原成分的迁移率相近,但抗原性不同;②平行弧:表示两个不同的抗原成分,它们的迁移率相同,但扩散率不同;③加宽弧:一般是由于抗原过量所致;④分枝弧:一般是由于抗体过量;⑤沉淀线中间逐渐加宽并接近抗体槽,一般由于抗原过量,在白蛋白位置处形成;⑥其它还有弯曲弧、平坦弧、半弧等。 2.沉淀弧的曲度 匀质性的物质具有明确的迁移率,能生成曲度较大的沉淀弧。反之有较宽迁移范围的物质,其沉淀弧曲度较小。 3.沉淀的清晰度 沉淀线的清晰度与抗原抗体的特异性程度有关,也与抗体的来源有关。抗血清多来源于兔、羊、马。兔抗体的特点是形成沉淀线宽而淡,抗体过量对沉淀线影响较小,而抗原过量,沉淀线发生部分溶解。马抗血清所形成的沉淀线致密、清晰,抗原或抗体过量时,复合物沉淀溶解、消失,而且产生继发性的非特异性沉淀。因此使用抗原抗体时,一定要找好适当的比例。 4.沉淀弧的位置 高分子量的物质扩散慢,所形成的沉淀线离抗原孔较近;而分子量较小的物质,扩散速度快,沉淀弧离抗体槽近一些。抗原浓度高沉淀弧偏近抗体槽,反之,抗体浓度过高,沉淀弧偏近抗原孔。
(五)注意事项 1.免疫电泳分析法的成功与否,主要取决于抗血清的质量。抗血清中必须含有足够的抗体,才能同被检样品中所有抗原物质生成沉淀反应。 2.抗血清虽然含有对所有抗原物质的相应抗体,但抗体效价有高有低,因此要适当考虑抗原孔径的大小和抗体槽的距离。 3.免疫电泳要求分析的物质一方为抗原,另一方为沉淀反应性抗体。因此没有抗原性的物质或抗原性差的物质、非沉淀反应性抗体,均不能用免疫电泳进行分析。

 
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