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士锋生物粗蛋白的定量测定—微量凯氏定氮法
点击次数:619 更新时间:2014-05-27

蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系,其中含碳50~55%、氢6~8%、氧20~23%、氮15~17%和硫0.3~2.5%。此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。
由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征,而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近,一般恒定在15~17%,平均值为16%左右,因此在蛋白质的定量分析中,每测得1克氮就相当于6.25克蛋白质。所以只要测定出生物样品中的含氮量,再乘以6.25,就可以计算出样品中的蛋白质含量。
生物样品中的含氮量可用以下反应来测定:

含氮有机物与浓硫酸共热,被氧化成二氧化碳和水,而氮则转变成氨,氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。由大分子分解成小分子的过程通常称为”消化”。为了加速消化,通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点(290℃→400℃),加入硫酸铜作为催化剂,过氧化氢作为氧化剂,以促进反应的进行。
反应(1)(2)在凯氏烧瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行,其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。由于蒸汽发生器体积小,节省能源,本仪器使用方便,效果良好。
硫酸铵与浓碱作用可游离出氨,借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中,硼酸吸收
氨后使溶液中的H+浓度降低,然后用标准无机酸滴定,直至恢复溶液中原来H+浓度为止,zui后根据
所用标准酸的量计算出待测物中总氮量。
三、仪器和试剂
仪器
消化管或凯氏烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、电炉、100mL 锥形瓶、100mL 量筒、表面皿、酸式滴定管、小漏斗、玻璃珠等。
试剂
1. 血清或卵清蛋白等其他含蛋白质样品
2. 消化液:30%过氧化氢、硫酸与水的比例为3∶2∶1,临用时配制。
3. 催化剂:硫酸铜(CuSO4•5H2O)与硫酸钾(K2SO4)以1:3配比研磨混合。
4. 50%氢氧化钠溶液
5. 2%硼酸溶液
6. 标准盐酸溶液(约0.01mol/L)
7. 混合指示剂(田氏指示剂)混合指示剂由50mL 0.1%甲烯蓝乙醇溶液与200mL0.1%甲基红乙醇溶液混合配成贮于棕色瓶中配用。这种指示剂酸性时为紫红色,碱性时为绿色,变色范围很窄且很灵敏。

四、实验步骤
(一)安装微量凯氏定氮仪
定氮仪由蒸汽发生器、反应室、冷凝管三部分组成。蒸汽发生器包括一个电炉及一个3~5升容积的烧瓶。反应室上边有两个小烧杯,一个供加样,一个盛放碱液。样品和碱液由此可直接到反应室中。反应室中心有一长玻璃管,其上端通到反应室外层,下端靠近反应室的底部。反应室下端底部有一开口,上有橡皮管和管夹。由此放出反应废液。反应所产生的氮可通过反应室上端细管经冷凝管通入收集瓶中。反应室与冷凝管之间由橡皮管相连。
安装仪器时,将蒸汽发生器垂直地固定在铁架台上,用橡皮管把蒸汽发生器、反应室、冷凝管连接起来。橡皮管连接的部位应在同一水平位置。冷凝管下端与实验台的距离以放得下收集瓶为准。安装完毕后,不得轻易移动,以免仪器损坏。要认真检查整个装置是否漏气,以保证所测结果的准确性。

 
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