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士锋生物植物原生质体的制备
点击次数:1044 更新时间:2014-07-30

一、实验目的 
原生质体是指植物细胞去掉细胞壁的裸露部分。它在培养条件下,①具有再生细胞壁,进行连续的细胞分裂并再生成完整植株的能力;②具有摄取外源大分子、细胞器,以及细菌,病毒的能力,因此是进行遗传操作,基因转移的好材料;③通过同种和异种植物的原生质体融合,可产生异核体,实现体细胞杂交,培育出新品种。通过此实验,要求初步掌握原生质体分离和培养的基本操作技术和方法。 
二、实验原理 
去掉植物细胞壁的方法可以是机械的人工操作,也可以利用酶解法。较早利用机械法制备原生质体的*Klercker(1892),直到1960年英国科学家Cocking才*次用酶法大量制备原生质体。本实验以植物的叶肉组织为材料,利用纤维素酶和果胶酶来消化细胞壁,分离细胞。 
三、实验用品 
器具:显微镜、离心机、离心管、剪刀(2)、镊子(2)、吸管、小培养皿、载片、盖片。 
试剂:0.16mol/L CaCI.2.H2O、20%蔗糖液、酶解液 
材料:油菜或菠菜或烟草 
四、实验方法步骤 
1、取材 根据实验目的和条件选取不同的材料 
2、分离原生质体 
① 撕叶下表皮 
② 酶解 将撕去下表皮的叶片剪成小块,放在盛有5mL酶液的小培养皿中,让去除下表皮的一面接触酶液,辅满一层,在25~28℃下酶解60~90分钟 
3、收集纯化 
(1)用吸管将酶解液吸至5mL离心管中,以600rpm离心5分钟以上,使原生质体沉降 
(2)将上清(酶解液)回收,剩下原生质体及残渣于管底 
(3)加氯化钙液约2mL,轻轻吹打均匀 
(4)用注射器向离心管底部缓缓注入蔗糖约2—3mL,出现下部蔗糖液,上部原生质体悬浮液 
(5)以600rpm离心10分钟,在两液相之间出现一条绿色带,便是纯净的原生质体 
4、观察或培养 
取少许原生质体于载片上,盖片观察其形态,或者将原生质体接种在培养基上进行培养,再生植株 
五、实验报告 
1、简述植物原生质体制备的方法步骤; 
2、按镜下观察绘制原生质体。

 
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