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肿瘤细胞培养成纤维细胞排除法
点击次数:857 更新时间:2014-09-19

1.机械刮除法:

是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头(用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝)、或裹少许脱脂棉制成,装入试管中高压灭菌后备用(也可用特制电热烧灼器刮除)。刮除程序为:

(1)标记:镜下观察,用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位;

(2)刮除:弃掉培养液,把无菌胶刮伸入瓶皿中,肉眼或显微镜窥视下,刮除无标记空间;

(3)用Hanks液冲洗一两次,洗除被刮掉的细胞;

(4)注入培养液继续培养,如发现仍有成纤维细胞残留,可重复刮除至*除掉为止

2.反复贴壁法:

根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点,并结合使用不加血清的营养液,把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁,使两类细胞相互分离,操作方法与传代相同。

(1)待细胞生长达一定数量后,倒出旧培养液,用消化后,Hanks 冲洗2次,加入不含血清的培养液,吹打制成细胞悬液;

(2)取编号为此A、B、C三个培养瓶;首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养5~20分钟后,轻轻倾斜培养瓶,让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液,再接种入B培养瓶中后;向A瓶中补充少许*培养液置温箱中继续培养;

(4)培养B瓶中细胞5~20分钟后,接处理A的方法,把培养液注入C培养瓶中;再向B瓶中补加*培养基。

当三个瓶内都含有培养液后,均在温箱中继续培养。如操作成功,次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞,B瓶两类细胞相杂,C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次,直至癌细胞纯化为止。

3.消化排除法:

此法曾用于乳癌细胞的培养,具体程序是:

(1)先是用0.5%和0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培养细胞一次,然后再换成新的混合液继续消化,并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶,到半数细胞脱落下来后,便立即停止消化;

(2)把消化液吸入离心管中,离心去上清,吸入另瓶中,加培养液置温箱中培养;向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后,成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理,可能把成纤维细胞除净。

4.胶原酶消化法:

本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点,通过消化进行选择。

(1)可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理,边消化边在倒置显微镜下窥视,当发现成纤维细胞被除掉后,即终止消化;

(2)用Hanks洗涤处理一次后,更换新培养液,继续培养,可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净,可再次重复。

5.其它方法:

有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用;也有人用聚蔗糖制备成比重1.025~1.085的密度梯度离心液,加入细胞悬液后,在23℃中800g离心 10分种。在比重1.025~1.050层为成纤维细胞,在比重1.050~1.085层为上皮细胞,再经过分离进行培养。zui近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。

选用上述任何一种方法,都需进行试验,取得必要经验,找出适合的条件,才能获得好的效果。

 
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