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几种常见细胞培养方法
点击次数:3317 更新时间:2014-10-22

巨噬细胞培养

巨噬细胞属免疫细胞,有多种功能,是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得,便于培养,并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群,在条件适宜下可生活2-3周,多用做原代培养,难以生存。

巨噬细胞也建有无限细胞系,大多来自小鼠,如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等,均获恶性,培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能,易于传代和瓶壁分离,但难以建株。

培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞,以小鼠腹腔取材法zui为实用,其法如下:

1、实验前三天,向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml(勿注入肠内!),以刺流产生大量的巨噬细胞。

2、引颈处死小鼠。

3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3-5秒。

4、置动物于解剖台,用针头固定四肢,持镊撕开腹部皮肤,但勿伤及腹膜壁,把皮肤拉向上下两侧,暴露出腹膜壁。

5、用70%酒精擦洗腹膜壁,注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中,同时用手指从两侧压揉腹膜壁,使液体在腹腔内流动。

6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧.使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。

7、小心拔出针头,把液体注入离心管。

8、4℃下250g离心10分钟后,去上清,加10ml Eagle培养基。

9、计数细胞。每只鼠可产生20一30×106细胞,其中90%为巨噬细胞。

10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。

11、接种数小时后,除去培养液,可去除其它白细胞,纯化培养细胞,用Eagle液冲洗1一2次,再加新Eagle培养液置CO2温箱中。

上皮细胞培养

1、取材:外科植皮或手术残余皮肤小块,早产流产儿皮肤更好,取角化层薄者,切成0.5-1平方厘米小块。

2、置0.02%EDTA中,室温,5分钟。

3、换入0.25%中,4℃过夜。

4、分离:取出皮块,用或镊子将表皮与层分开。

5、取出表皮,剪成更小的块后,置0.25%中,37℃,30—60分钟。

6、反复吹打,制成悬液。

7、培养:用80目不锈钢纱网滤过后,低速离心,吸去上清。

8、直接加入培养基(Eagle加20%小牛血清)制成细胞悬液,接种入培养瓶,CO2温箱培养。体细胞培养

1、琼脂铺底的培养瓶:30ml无菌培养瓶,每瓶中加5 ml 2%琼脂培养基,冷却,形成平坦底层后备用。

2、取生长状态良好已连接成片的细胞,用弯头吸管伸入瓶内,把细胞纵横割划成若干小区后,倒出培养液。

3、加入0.25%的液,在倒置显微镜下边消化边观察,当细胞小区边缘微卷起后便立即终止消化,倒出消化液,用Hanks轻轻漂洗一次,加入新培养液3~5 ml,用吸管把已松动的细胞片吸打下来,分装入1~3个含2%琼脂培养基底层的培养瓶中,置温箱继续培养,数日后便可生长成细胞球体。

4、换液:培养1~2日后,如需换液,微倾斜培养瓶,令培养液集于培养瓶底角,停片刻,待球体细胞下沉后,吸除部分培养液,再补充新培养液。

羊水细胞培养

羊水中含有胎儿脱落的上皮细胞,可在体外培养用以分析胎儿染色体核型。目前国内外大都采用腹腔羊膜穿刺术,妊娠12-30周的羊水细胞均可培养成功。羊膜腔穿刺取羊水行染色体分析,*孕周为16周左右。因此时羊水增长快,羊水中细胞较多,细胞培养易于生长,而且不易损伤胎儿。国内多数选择的穿刺时间在妊娠的第16-30周。国外现已较多地采用妊娠早期的羊膜穿刺,但需在B超下定位及穿刺。羊水量按妊娠时间大致计算(1ml/w)。资料表明,穿刺病例的妊娠结局、分娩方式、胎儿的出生体重等与未穿刺无明显差异。

1、实验材料

2,5%碘酒、75%酒精、无菌棉签和棉球、镊子、20-22号无菌腰穿针、吸管、培养瓶、培养液(PRMI 1640、199、F10、F12)、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、培养皿、盖玻片等。

2、培养液配制

F-12 85%

小牛血清 15%

双抗 100u/ml

小瓶贮藏 4-8℃

3、操作过程

A(盖玻片培养法)

(1)采样:选择妊娠13-14周妇女,在无菌条件下抽取羊水5ml,立即注入无菌离心管中;(2)收集:离心分离细胞,1000rpm10分钟,去上清,留0.5ml,轻打混匀;(3)接种:30mm培养皿中放盖玻片1张,每片滴混匀的细胞液1-2滴,置培养箱内培养30-60分钟;(4)培养:取出后从盖玻片外加培养液2ml,静置培养48小时后观察细胞生殖状况并定时换液,5-10天后,可见大量成纤维细胞或上皮样细胞生长;(5)终止培养:当有大量圆形发亮细胞出现时,加秋水仙素0.02-0.04ug/ml,作用10-12小时;(6)低渗:倒掉培养液,加预温37℃0.075MKCL溶液5ml,37℃温育30分钟,镜下可见胀大的羊水细胞,加0.5-1ml 3∶1甲醇:冰醋酸固定液预固定;(7)固定:倒掉低渗液,加5ml固定液固定30分钟以上,反复3次;(8)干燥:将附有细胞的盖玻片斜放于培养皿中,置80℃烤箱处理2-3小时;(9)胶片:将附有细胞的盖玻片用树脂胶封固于玻片上,正面朝外,小心细胞破坏;

B(常规培养法)

(1)—(2)相同于盖玻片培养法;(3)接种:将混匀的羊水细胞种置于50ml或100ml细胞培养瓶内,平均10ml羊水细胞收集的细胞种置一瓶加5-10ml混合培养液。(4)培养:酒精灯火先封口,静置培养48小时后观察细胞贴臂及生长情况,5-10天后可见瓶底面有大量羊水细胞生长;(5)终止培养:同A法;(6)细胞收集:将培养液倒入一干净离心管中,加0.025%的0.5-1ml/瓶,轻轻摇动,使培养瓶底面*接触消化酶,然后用弯头吸管吹打,待细胞全部脱落后加前培养液终止消化。用吸管移细胞悬液于离心管中。1000-2000rpm10分钟,弃上清,留细胞沉虑。若一次消化不*,可反复消化;(7)低渗及预固定:加预温37℃KCL溶液10ml,37℃温育30分钟,加0.5-1ml新鲜配制的3∶1甲醇冰乙酸固定液预固定,用气泡吹打细胞使其混匀。(8)固定:用新鲜配制的3∶2甲冰固定三次,每次30分钟。固定液加入时沿管壁缓慢加入;(9)制片及干燥:用绒毛制片;(10)分带处理。

血管内皮细胞培养

研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法zui为简便,其法如下:

1、产后新鲜脐带,无菌剪取10—15厘米长一段,如不能立即培养,可于12小时内保存于4℃。

2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血,在入口处用线绳扎紧,以防液体返流。

3、用夹紧脐带一端,从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的粗制胶原酶,充满血管,消化3—10分钟;注入口用线绳扎,以防液体返流。

4、吸出含有内皮细胞的消化液,于离心管中,注入温PBS轻轻反复冲洗后,一并注入离心管中(此步骤可重复)。5、离心去上清,加入RPMI1640培养液制成细胞悬液,接种入培养器皿中,置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。

原代软骨细胞分离培养

1、一般根据实验要求,选取不同年龄组的兔子,实际上兔子的年龄越小越好,毕竟幼体组织的活力要高于成体组织的活力,耳静脉空气注射法处死后,无菌条件下分离后肢关节软骨和肋软骨,剥离包裹软骨组织的筋膜和软骨膜,放入盛有PBS液的培养皿中。

2、将分离得到的软骨组织剁碎成0.3-0.5mm的组织块,移入25cm2培养瓶,用含双抗的PBS液冲洗软骨3次。

3、加入软骨体积10-15倍的0.25%,37℃消化1-2小时后终止消化。

4、加入0.02%II型胶原酶,37℃消化17-20小时(也就是过夜),这是我们实验室摸索出来的方法,虽然比较浪费时间,但是获得的细胞活力确实不错。

5、在倒置显微镜下观察,当游离出单个细胞后,加入DMEM培养液将II型胶原酶稀释终止消化。

6、将细胞团吹打成单个细胞后用200目滤网过滤,收集滤液,1500r/min离心5min。

7、弃上清,加入DS培养液重悬,0.2%台盼蓝染色,活细胞率大于90%,CO2培养箱孵育。

 
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