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细胞技术及活力测定
点击次数:597 更新时间:2014-11-21

一、原理

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好,所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞,总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力,由组织中分离细胞一般也要检查活力,以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力,了解冻存和复苏的效果。

用台盼兰染细胞,死细胞着色,活细胞不着色,从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应,也可测定细胞相对数和相对活力。

二、仪器、用品与试剂

1、仪器与用品:普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪(或分光光度计)

2、试剂:0.4%台盼兰,0.5%四甲基偶氮唑盐(MTT)、酸化异丙醇

3、材料:细胞悬液

三、操作步骤

(一)细胞计数

1、将血球计数板及盖片用擦试干净,并将盖片盖在计数板上。

2、将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片和计数板之间。

3、静置3分钟。

4、镜下观察,计算计数板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算:

细胞数/ml=4大格细胞总数/ 4×10000

注意:镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算,若细胞团占10%以上,说明分散不好,需重新制备细胞悬液。

(二)细胞活力

1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。

2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液,染色2一3分钟。

3、吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片。

4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计细胞活力。

死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见深兰色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状。

活力测定可以和细胞计数合起来进行,但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。

(三)MTT法测细胞相对数和相对活力

活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比,也与细胞活力呈正比。

1、细胞悬液以1000rpm离心10分钟,弃上清液。

2、沉淀加入0.5-1ml MTT,吹打成悬液。

3、37℃下保温2小时。

4、加入4-5 ml酸化异丙醇(定容)。打匀。

5、1000 rpm离心,取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色,酸化异丙醇调零点。

注意:MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞数。

附:1、0.4%台盼兰染液配制:

台盼兰 0.4克 加双蒸水至100 ml.

2、MTT配制:

MTT 0.5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4℃下保存。

3、酸化异丙醇配制:

异丙醇中加入HCl使zui终达0.04mol/L。

 
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