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mRNA差异PCR技术
点击次数:466 更新时间:2015-08-11

生物界的丰富多彩很大程度上取决于严格调控下的基因的选择性表达。高等生物的细胞内约含有105个不同的基因,而主 基因在某个特定的细胞中,只有占15%的一小部分表达。而且在不同的细胞中,选择性表达的基础也是不同的。正是这些基因的选择不同决定了整个生命的过程:如细胞的生长分化,激素和细胞困子对细胞的作用、细胞周期的调控以及衰老、死亡等。和细胞的正常生理一样,一些病理的反应如肿瘤等也是由基因表达的改变引起的。所以,这种基因的选择性表达,是细胞生物学要研究的核心问题之一,而对于这一问题的研究方法也是分析生物发育和调控机制的一种重要方法。
以往,研究基因表达差异的主要方法是双向蛋白质电泳指纹图谱和依赖杂交的筛选技术。这两种技术各有自己的适用范围和优点。蛋白质指纹技术具有很高的灵敏度,可以很方便地区分出不同的表达产物,但往往得不到足够的量来分析和克隆它们的基因;而杂交技术则需要较长的周期和繁琐的步骤,也易发生基因的丢失。所以多年以来,人们一直想找出一种更方便有效的替代方法。

哈佛大学医学院的Peng Liang和Arthur B.Pardee博士发明的mRNA差别显示即DD法(differential display of mRNA by PCR), 是一种新的研究基因差异表达的有力工具。这个方法的离要程序是将细胞内的m RNA抽提出来,反复录成cDNA,尔后经PCR随机扩增, 通过在测序凝胶上电泳条带的比较筛选出不同的表达的基因,并回收这些DNA片段,经扩增后作为探针,在c DNA或基因组DNA库中扫描找到相关基因。原则上如果选用不同的引物组合,这个方法可以检测到细胞中约15000种不同基因的表达情况, 这就给出了一个类似于蛋双向电泳的指纹图谱,基因表达的不同马上就可以知道,并因此分离到该基因。

由于这种方法主要依赖于PCR技术,所以选择合知的引物是这一方法成功的关链。用于逆转录合成单链cDNA和PCR扩增的3"引物设计得益于许多真m RNA共有的polyA尾巴,所以oligo dT作引物就可锚定在polyA上。 加之又在引物的3"端加了两个碱基,它们将随机地与mRNA的polyA上游两个碱基配对,由于这两个碱基有12种不同的组合,从而将有的mRNA分成12个组。 这样就减少了每次分析的mRNA数量,提高了分辨率。后来这一引物的设计又得到了改进, 将倒数第二个碱基改成了一个简并碱基,从而将3"引物的数量减少到4个, 分别是5"T12NA3"、5"12NG3"、5"T12NT3"和5"12NC3"(其中N是d A、dG或dC),这样就将所有mRNA分成了4组, 这一改进既减少了引物的用量和需要分析的次数,又保证了足以灵敏地检测到所有可能的表达产物。

在获得cDNA以后进行的PCR扩增中,5"所用的引物是一组随机引物,引物的选择关键在于它们的长度。理论上这个长度要满足两个条件:一是要和m RNA有合适的配对效率,其次则是必须符合PCR引物的要求。从为了获得较高的配对概率来讲,这个引物应足够短,以具有更高的灵敏度,6到7个碱基被认为是合适的长度。但是很明显,这样一个引物用于PCR扩增是太短的,虽说在用PCR研究 DNA多态性的实验中,8 ̄10个碱基长的引物也被应用,但一般PCR所用的上物往往有20个碱基或更长。经过选择不同长度引物是适宜的,下表是实验的结果:

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随相引物的长度 配对几率 陈列的mRNA数

(个)

━──────────

(碱基数) (千碱基/配对位点) 理论值 实际结果

 
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