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士锋生物目的基因的亚克隆
点击次数:568 更新时间:2015-08-27

所谓亚克隆就是对已经获得的目的dna片段进行重新克隆,其目的在于对目的DNA进行进一步分析,或者进行重组改造等。
亚克隆的基本过程包括:(1)目的DNA片段和载体的制备;(2)目的DNA片段和载体的连接;(3)连接产物的转化;(4)重组子筛选。 
一、试剂准备
1.LB液体培养基:胰化蛋白胨(细菌培养用)10g,酵母提取物(细菌培养用) 5g,NaCl 10g,加ddH2O 至1000ml,*溶解,分装小瓶,15lbf/in2高压灭菌20min。
2.1.5%琼脂LB固体培养基: 称取1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶,加100ml LB,15 lbf/in2 高压灭菌20min,稍冷却,制备平皿。
3.IPTG、X-Gal
4.0.1M MgCl2 :15 lbf/in2高压灭菌20min,0℃冰浴备用。
5.0.1M CaCl2(以20%甘油水溶液配制):15 lbf/in2高压灭菌20min,0℃冰浴备用。
6.限制性核酸内切酶、T4 dna连接酶。
二、目的DNA片段和载体的制备
选择适宜的限制性核酸内切酶,消化已知目的DNA和载体,获得线性DNA,用于重组。根据目的DNA和载体的具体情况,选择一种或者两种适当的限制酶切割,分别产生对称性粘性末端(用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端)、不对称粘性末端(用两种不同的限制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端)、平端。在亚克隆时,不对称相容末端连接,次选对称性粘性相容性末端连接,由于平末端连接效率较低,通常很少采用。但有时目的片段的末端与载体不匹配 ,一般先将不匹配末端补平,然后再以平末端连接。(实验操作同前述) 
三、利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接
(一)连接要求和结果 
外源DNA片段末端性质 连接要求 连接结果 
不对称粘性末端 两种限制酶消化后,需纯化载体以提高连接效率 载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留;非重组克隆的背景较低;外源DNA可以定向插入到载体中。 
对称性粘性末端 线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理 载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留;重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝;外源DNA会以两个方向插入到载体中。 
平端 要求高浓度的DNA和连接酶 载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失;重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝;非重组克隆的背景较高 。 
带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此,必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度,以便使“正确"连接产物的数量达到*水平,此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接反应,也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸(未脱磷),可形成4个新的磷酸二酯键;如载体DNA已脱磷,则只能形成2个新的磷酸二酯键,此时产生的重组DNA带有两个单链缺口,在导入感受态细胞后可被修复。
(二)T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案
1.连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。
2.10μl体积反应体系中:取载体50-100ng,加入一定比例的外源DNA 分子(一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5),补足ddH2O 至8μl。
3.轻轻混匀,稍加离心,56℃水浴5min后,迅速转入冰浴。

 
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