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DNA的限制性内切酶酶切
点击次数:1062 更新时间:2015-10-12

实验目的 
1. 学会DNA限制性内切酶酶切技术。 
2. 琼脂糖凝胶电泳法观察酶切DNA的结果。 

实验原理 
质粒pUC118上有限制性内切酶BamHI的识别序列G↓GATCC,用BamHI酶切后形成线性质粒dna。琼脂糖凝胶电泳可以按酶切产物分子量的大小分离DNA片段,小片段比大片段迁移快,凝胶上迁移的距离与分子量的对数成反比。要准确地确定DNA片段的大小,必须用分子量标准物同时进行电泳对照。常用的分子量标准是lDNA/EcoRI、lDNA/HindIII、lDNA/EcoRI+HindIII的酶切片段
DNA的限制性内切酶酶切
DNA的限制性内切酶酶切
实验材料和试剂 
(一)实验材料 
实验二提取的质粒pUC118??? 
(二)试剂 
1.限制性内切酶BamHI 
2.l DNA/HindIII分子量标准 
3.双蒸馏无菌水 
4.溴酚蓝指示剂点样缓冲液 
5.1mg/ml溴化乙锭溶液 
6.电泳缓冲液(TAE) 
7.0.7% 琼脂糖凝胶(用TAE电泳缓冲液配制) 

(三)器材 
1.5ml Eppendorf管 200ml吸头 
(四)仪器 
微量移液器 离心机 
恒温水浴锅 电泳仪 
水平电泳槽 透射紫外观察仪

实验步骤 
1. 取一个灭菌的Eppendorf管,依次加入下列试剂: 
双蒸馏无菌水 12ml 
10×BamHI缓冲液 2ml 
质粒pUC118 5ml 

BamHI 1ml 
总体积 20ml 
2. 用手指轻弹管壁,使各种试剂混匀,快速离心,以集中溶液。 
3. 置37℃水浴60~120 分钟。 
4. 加入5ml溴酚蓝指示剂点样缓冲液,按实验三方法电泳,观察酶切反应结果,鉴定酶切效果。

【提示】
实验操作中注意的问题
1. 酶切反应用的Eppendorf管和吸头,都要用新的,用双蒸馏水洗净,灭菌。使用前打开包装,用镊子夹取,不要直接用手去拿,以防手上的杂酶污染。
2.DNA样品和限制性内切酶的用量都极少,必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。
3.要注意酶切加样的次序,一般次序为双蒸馏无菌水、缓冲液、DNA各项试剂,zui后才加酶。
4.取酶时,吸头要从酶液的表面吸取,以防止吸头沾上过多的酶液。待用的酶要放在冰浴内,用后盖紧盖子,立即放回-20℃冰箱中,防止酶失活。
5.当样品在37℃保温时,要将Eppendorf管的盖子盖紧,防止因盖子未盖严密使水进入管内,造成实验失败。

 
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