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兔肝RNA的制备及测定
点击次数:539 更新时间:2015-11-10

实验目的:
学习从兔肝中提取RNA的方法。
通过地衣酚显色法测定RNA的含量。

实验原理:
细胞内大部份RNA均与蛋白质结合在一起,并且多以核蛋白的形式存在。因此,分离制备RNA时,首先遇到的是必须使RNA与蛋白解离,并除去蛋白质。由于RNA的种类来源和存在形式不同,所用的制备方法各异,一般常用的方法有,盐酸胍法,去污剂法和法。其中,以法使用较为广泛。产品纯度高,适合小规模生产。
动物组织中以肝脏器官RNA含量较为丰富。经组织匀浆用处理并离心后RNA溶于上层被酚饱和的水相中,DNA和蛋白质则留在酚层中,向水层中加入乙醇后,RNA即以白色絮状沉淀析出。此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA;其工艺简单,所提取的核酸均为变性RNA,只能用作制备核苷酸原料。本实验就是将兔肝组织,在酚与十二烷基硫酸钠的存在下,RNA与蛋白质分离使蛋白质变性凝固。RNA溶解在水相中,用乙醇使RNA从水相中沉淀,达到分离。
RNA含量的测定,除了可用紫外吸收法及定磷法外,常用地衣酚法测定,其反应原理是当RNA与浓盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变成糠醛,后者与3, 5-二羟甲苯(地衣酚orcinol)反应,在Fe3+或Cu2+催化下,生成鲜绿色的复合物.反应产物在670nm处有zui大吸收。RNA在20-250微克范围内,光吸收与RNA浓度 成正比。地衣酚反应特异性较差,凡是戊糖均有此反应。DNA和其他杂质也能给出类似的颜色。

实验试剂
0.05mol/L醋酸缓冲液(PH5.0)
0.05mol/L醋酸钠35毫升, 0.2mol/L醋酸15毫升,加蒸馏水至1000毫升,混合后测PH5.0
25%SDS:称取SDS25克,溶于50%乙醇中至100毫升,室温存放。
80%酚:取80份,加蒸馏水20份,混匀后装棕色瓶中。
2mol/L醋酸钠:取无水醋酸钠16。4克,用蒸馏水溶解后配成100毫升
95%乙醇

操作步骤
RNA提取:将新鲜兔肝浸入预冷0度0.05mol/L醋酸钠缓冲液(PH5.0)中,除去肝脏处的结缔组织,除去血凝,用滤纸吸干,称取0.9克.
取0.9克肝脏,加入 0.05mol/L醋酸缓冲液(PH5.0)9毫升,250克/升.SDS1.5毫升,移入匀浆管中,匀浆后再加入等体积80%酚,再匀浆一次.
移入三角瓶中,置65度水浴中继续振摇5-8分,取出流水冷却.

离心,3000转/分,10-15分,上层为稍混浊,含有RNA的水相,中层为变性蛋白,下层为酚液,管底残渣,含有RNA.吸出上层水溶液要RNA的收获量,可向中下层液中再加1/2体积的醋酸缓冲液,同样在65度水浴中振摇提取一次,离心后所收得的上层水液,可与上述水液合并,本次实验只提取一次.
用量筒测水液的量,加入1/10体积的2mol/L醋酸钠混匀.再加入2.5倍体积预冷的95%乙醇混匀,冷却放置絮状沉淀充分形成.

离心3000转/分,10分钟,倾出上清(不要废弃,可倒入收集瓶,作蒸馏回收乙醇用.
沉淀用蒸馏水4毫升溶解,慢慢向沉淀中加入蒸馏水,不断搅拌,至沉淀*溶解即可,待作含量测定.

提取过程


RNA含量测定 
标准曲线制作:取试管12只,按下表编号加入试剂,加毕,摇匀,沸水浴中加热25分钟,取出后冷水冷却,测定各管0D670为纵坐标,RNA浓度为横坐标作图

测定过程

管号/试剂ml
0

1

2

3

4

5

6

7

RNA标准液

0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0


蒸馏水

2.0

1.6

1.2

0.8

0.4

0


地衣酚试剂

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0

2.0



取两支试管各加入0.2ml待测液,再加1.8ml水和2.0ml地衣酚试剂,加毕,摇匀,沸水加热25分钟,取出后冷水冷却,测定各管OD680为纵坐标,RNA浓度为横坐标作图并计算提出的RNA 的量。并计算出RNA的收率.

 
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