1 实时定量RT - PCR的原理、方法和应用
1. 1 实时定量RT - PCR的原理
实时定量pcr的发明归功于两个重要的发现:一是发现DNA Taq酶有5′ 3′外切酶活性,二是利用荧光能量传递技术构建了双标记寡核苷酸探针,即TaqMan探针。在PCR过程中,这些荧光信号可以被探测器所“即时”捕获,电脑软件可以通过等式ΔRn = R+n - R-n 计算ΔRn ,其中, R+n 是表示每点测量的荧光强度, R-n 表示荧光基线强度,ΔRn 的值表示PCR过程中,探针降解的量,就是PCR产物的量[ 3 ] 。以ΔRn的值对循环数作曲线,选择一个荧光阈值,荧光达到荧光阈值的循环数叫做阈值循环数(Cycle Threshold,Ct ) ,而Ct 值随这些起始模板量的增加而线性降低,从而可以通过Ct 值推算起始模板量。该方法的特异性由引物和探针的特异性所决定,只有在PCR过程中,探针退火到目标片段才能发出荧光信号。
SYBR Green I是一种DNA结合染料,能非特异地掺入到双链DNA中去,在游离状态下,它不发出荧光,但一旦结合到双链DNA中以后,便可发出荧光,可以与任意引物、模板相配合,用于任意反应体系中,因此,在一个反应体系内,其信号强度代表了双链DNA分子的数量。它的缺点是能与非特异性双链DNA(如引物二聚体)结合,但其产生的干扰可通过熔解曲线分析得到解决[ 4 ] 。
分子信标(molecular Beacons) ,是一种单链DNA形成的发夹结构,在其一端有一报告基团,在另一端有淬灭基团,当它形成发夹结构时,由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近,两者之间发生荧光信号能量共振转移( FRET) ,当热循环温度达到分子信标的解链温度时,其构象发生改变,能与模板结合而*伸展成线性分子,使得FRET消失,报告基团发出荧光信号。
Amp liSensor技术:该技术与Taqman PCR的区别在于其采用的是复合探针。一个探针上标以荧光报告基团,另一个探针上标以荧光淬灭基团,后者的5′端较前者多出7个碱基(GCGTCCC) 。两探针之间能因碱基互补而结合,此时,两基团靠近而形成FRET结构,报告基团的荧光信号被淬灭基团吸收。当两探针分开后,其间的FRET关系受到破坏,淬灭基团的抑制作用解除,报告基团的荧光信号得到释放。在PCR扩增前需将该复合探针与一个半套式PCR引物连接,该引物的5′端应具有一段与长探针上多出的7个碱基互补的序列,以便DNA连接酶能将该引物与短探针连接,扩增时,该探针- 引物复合物作为半套式引物掺入到模板,并释放出淬灭探针,使原有的FRET结构破坏,从而释放出报告基团的荧光信号,其强度与被扩增的模板数相对应[ 5 ] 。
L ightcycle技术:该技术的特点也是将荧光报告基团和淬灭基团分别标记在两个不同的探针上,形成荧光探针和淬灭探针。荧光报告基团标记探针的5′端,荧光淬灭基团标记探针的3′端,两探针能分别与模板同一条链中相邻的核苷酸序列进行杂交。当探针游离时能检测到报告基团的荧光信号,如果反应体系中存在特异性模板, PCR复性阶段两探针即会与之杂交,此时两探针上的荧光报告基团和淬灭基团相距较近,形成FRET关系,前者的荧光信号被后者吸收,即发生荧光淬灭。由于荧光淬灭的程度与被扩增的模板量相对应,可达到定量目的[ 5 ] 。
Comp lex探针技术:该技术的特点是先合成荧光探针和淬灭探针,荧光探针为25个碱基左右, 5′端有荧光报告基团,淬灭探针长度为15个碱基左右, 3′端有荧光淬灭基团,并能与荧光探针5′端杂交。当荧光报告基团与淬灭基团靠近时,荧光信号被吸收。当反应体系中没有特异性模板时,不能检测到报告基团的荧光信号。当有特异性模板存在时,在PCR复性阶段荧光探针优先与模板结合,以致两探针分离,报告基团的荧光信号可被释放出来,其强度与被扩增的模板数量成正比,因而可进行PCR定量[ 5 ] 。
1. 2 方法
首先提取细胞因子mRNA,合成cDNA,可以采用TR Izol试剂盒,也可以采用Higher Pure RNA isolationkit从组织中提取RNA,所得到的RNA必须有较高的纯度,且不含DNA;然后,确定管家基因,设计引物和探针;再进行PCR扩增和基因定量。