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避免RNA酶污染的方法
点击次数:786 更新时间:2015-12-09

RNase酶非常稳定,是导致RNA降解zui主要的物质。它在一些的条件可以暂时失活,但限制因素去除后又迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的RNase*失活。为了获得高质量的真核细胞mRNA,必须使用RNA酶的抑制剂或采用下述的破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法,zui大限度地降低细胞破碎过程中所释放的RNA酶的活性。同时,避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量RNA酶也很重要。下面列举避免RNA酶污染问题的一些注意事项。大多数有经验的研究者并不拘泥于这些注意事项,只是在遇到问题时可能采用其中的一种或几种方法加以解决。我们谨将下述内容作为解决RNA酶污染问题的实验指南。 

1.塑料制品:尽可能使用无菌、一次性塑料制品。已标明RNAse-free的塑料制品,如没有开封使用过,通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品,有些厂家提供的产品已达到RNase-free,可以直接使用,再次处理容易造成二次污染,得不偿失。但原则上国产塑料制品处理后方可使用。处理方法如下: 
(1)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入焦碳酸二乙酯(DEPC)使DEPC的终浓度为0.1%。注意:DEPC有致癌之嫌,须在通风柜中小心操作。 
(2)将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC水溶液,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。 
(3)在通风柜中37℃或室温下处理过夜。 
(4)将EDPC水溶液小心倒入废液瓶中,用铝箔封住含DEPC水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少30分钟。上述处理可以除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。 
(5)用合适的温度(80-90℃)烘烤至干燥,置于干净处备用。 

2.玻璃和金属制品: 实验室用的普通玻璃和金属器皿经常有rna酶污染,使用前必须于180℃干烤8小时或250℃烘烤3小时以上。另一种方法是用0.1%的DEPC水溶液浸泡。 

3.电泳槽:用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净,再用水冲洗,用乙醇干燥,然后灌满3%的H2O2溶液,于室温放置10分钟,然后用0.1%DEPC处理过的水*冲洗电泳槽。能留出一些玻璃器皿,塑料制品和电泳槽作上特殊标记,存放在地点,为RNA实验。 

4.移液器: RNase的又一污染源是移液器。根据移液器制造商的要求对移液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗移液器的内部和外部,基本达到要求。移液器金属退头器是RNA酶的一个重要来源,实验前取下它。 

5.溶液:用高压灭菌的水和RNA研究的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液应用0.1% DEPC水于 37℃至少处理12小时,然后于100℃加热15分钟或在15 lbf/in2(1.034×105Pa)的高压下蒸气灭菌30分钟。注:DEPC可与胺类迅速发生化学反应,因此不能用来处理含有Tris一类的缓冲液,可存几瓶新的,未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。 

6.研究人员: RNA酶广泛存在于人的皮肤上,zui主要的潜在污染源是研究人员的手。因此,在准备分离和分析RNA的材料和溶液时,以及在涉及RNA的一切操作过程中,都应戴一次性手套,接触“脏的”玻璃器皿和其他物品以后,手套就可能沾染上RNA酶,因此进行RNA实验时应勤换手套。

 
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