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TAIL详细介绍
点击次数:719 更新时间:2016-02-22

在分子生物学研究中,基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA序列邻近的未知序列,TAIL-PCR又叫热不对称交错PCR,能够较好地解决上述难题。该技术通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环,利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段,所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。

TAIL-PCR技术简单易行,反应灵敏,产物的特异性高,重复性好,能够在较短的时间内获得目标片段,已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。经改良过的TAIL-PCR成功地从突变体中克隆到外源插入基因的旁侧序列,从而为启动子的克隆提供了有效的新方法。 

在利用特异引物和随机引物进行PCR中一般有3种产物生成:
①由特异性引物和简并引物扩增出的产物;
②由同一特异性引物扩增出的产物;
③由同一简并引物扩增出的产物。

在TAIL-PCR反应中,其中后2种目标产物可以通过以嵌套的特异性引物进行的后续反应来消除。TAIL-PCR的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物(special primer,简称sp1,sp2,sp3,约20bp),用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物(arbitrary degenerate prime,AD,约14bp)相组合,以基因组DNA为模板,根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环,通过分级反应来扩增特异引物。TAIL-PCR共分3次反应。

*次反应包括5次高特异性、1次低特异、10次较低特异性反应和12个热不对称的超级循环。5次高特异性反应,使sp1与已知的序列退火并延伸,增加了目标序列的浓度;1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上;10次较低特异性反应使2种引物均与模板退火,随后进行12次超级循环。经上述反应得到了不同浓度的3种类型产物:特异性产物①型和非特异性产物(②型和③型)。

第二次反应则将*级反应的产物稀释1000倍作为模板,通过10次热不对称的超级循环,使特异性产物被选择地扩增,而非特异产物含量极低。第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板,再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环,通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。

 
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