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SSR标记实验步骤
点击次数:850 更新时间:2016-05-18

SSR简单序列重复标记(Simple sequence repeat, 简称SSR标记),也叫微卫星序列重复,是由一类由几个核苷酸(1-5个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列,长度较短,广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不*相同,造成了SSR长度的高度变异性,由此而产生SSR标记或SSLP标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同,但是其两端序列多是保守的单拷贝序列,因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物,通过PCR技术,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。
优点:(1)标记数量丰富,具有较多的等位变异,广泛分布于各条染色体上;
(2)是共显性标记,呈孟德尔遗传;
(3)技术重复性好,易于操作,结果可靠。
缺点:开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息,而且引物合成费用较高。

操作程序:
取叶片→磨样→提取DNA→pcr扩增→电泳检测→染色→读带标记
1、DNA提取
按照Doyle和Dickson(1987)CTAB法(`Cetyl triethyl ammonium bromide)并略加改进的程序进行,具体步骤如下:
① 成熟期取叶片加液氮研磨成粉末状,转入1.5ml离心管中,-20℃冰箱保存;
② 加入600ul 65℃的2×CTAB混匀并置于65℃水浴中保温30~60分钟;
③ 取出,冷却,上下摇匀后,加入600微升24:1的氯仿异戊醇;
④ 12000转/分钟离心10分钟,取上清液于另一个1.5ml的离心管中;
⑤ 加异丙醇,12000转/分钟离心10分钟,倒掉上清液;
⑥ 干后用的洒精清洗,干后加适量TE
2、PCR扩增
模板DNA的浓度大约25ng/ul,扩增反应体系为20ul。具体如下:
Sterile ddH2O 11ul
PCR Buffer 3ul
dNTP-mix 0.5ul
Primer1 1ul
Primer2 1ul
Taq polymerase 0.5ul(2U/μL)
DNA 3ul
PCR扩增程序为:(2h30min)
① 预变性:94℃,5分钟;
② 变 性:94℃,40秒;
③ 退 火:55℃ 40秒;
④ 延 伸:72℃,1分钟;
⑤ 循 环:从2到4共38个循环;
⑥ 72℃下zui后延伸5分钟;4℃ 5min,扩增产物置于4℃的冰箱保存。
3、扩增产物的电泳分离
制胶→灌胶→上样→电泳
扩增产物用8%的聚丙烯酰胺变性胶电泳分离,步骤如下:
① 准备电极液(1×TBE);
② 将梳子拨出,并迅速用电极液冲洗胶面;
③ 不预电泳;
④ 点样,电泳220v;
⑤ 拆板,并及时将内板、边条及梳子洗净。
4、凝胶染色
① 固定:10%醋酸,5分钟;
② 染色:10分钟;
③ 漂洗:dH2O,5~10秒;
④ Na2S2O3 1min 
⑤ 显色:甲醛- NaOH,直到满意为止;
⑥ 漂洗:dH2O,2分钟。
5、自封带封胶,读带标记,数码照相摄像,室温风干。

 
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