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DNA重组实验方法
点击次数:669 更新时间:2016-05-23

DNA重组是将外源DNA与载体分子连接,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。 重组的DNA分子是在dna连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶,它不但能使粘性末端的DNA分子连在一起,而且能使平末端的双链DNA分子连接起来,但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
如果是单酶切,为了防止载体本身的自身连接,可以用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理,去掉酶切后5"端的磷酸。这样做能有效防止质粒的自身环化,降低转化的背景,大大提高重组子的筛出效率。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性,但是在这样的温度下,粘性末端的氢键结合是不稳定的。一般的连接条件是在12-16℃,反应12-16小时(过夜),这样既可zui大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到粘性末端短暂配对结构的稳定。
连接产物转化宿主细胞后,还须对转化菌落进行筛选鉴定,挑选出所需的重组质粒。


(一)仪器
1.恒温摇床
2.恒温水浴
3.恒温培养
4.小型高速离心机
(二)材料
1. 氨苄
2. BamHI
3. HindIII
4. T4 DNA连接酶
5. pQE-31 和pUC18-CAT 质粒
6. 培养皿
7. 接种针
8. 金属涂棒
9. 1.5mL 离心管
10.酒精灯
11.镊子、灭菌牙签等
(三)试剂
DNA琼脂糖胶纯化试剂盒(3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit,申

[实验步骤]
(一)质粒DNA
用实验二提取的pQE-31和pUC18-CAT 质粒。
(二)制备重组DNA
1.在灭菌的1.5mL 离心管中,加入pQE-31质粒10mL(2mg/mL),2mL酶切缓冲液,1mL BamHI 和HindIII酶 的混合液(各含10个单位),无菌双蒸水7mL,至反应混合物总体积为20mL,离心混匀,37℃反应过夜。
2.在另一无菌1.5mL 离心管中,加pUC18-CAT 质粒20mL,加入3mL酶切反应液,lmL BamHI和HindIII酶的混合液,无菌双蒸水补到30mL,37℃反应过夜。
3.反应完毕后取5mL pQE-31质粒的酶切液做电泳分析,检验酶切是否*。酶切*,进行下一步。
4.将酶切处理的后pQE-31和pUC18-CAT 质粒,分别上样跑琼脂糖凝胶电泳(注意加DNA分子量标准)。电泳结束后用DNA琼脂糖胶纯化试剂盒按照试剂盒说明书的方法回收DNA片段。前者回收的片段为3.5kb,后者为650bp。
5.将回收的pQE-31载体质粒均分为两份,其中一份与酶切后回收的CAT片段混合,做连接;另一份不加CAT片段,做对照。操作如下:
在10mL DNA样品中, 加T4 DNA连接酶缓冲液1mL,T4 DNA连接酶1mL,14℃(室温)过夜,然后做大肠杆菌的转化。
(三)转化感受态细胞
1.用实验一制备的感受态细胞(-20℃保存的)。
2.在100mL的融化后处于冰浴的感受态细胞中,加入10mL连接产物,混匀,冰上放置30分钟,以后的操作参照实验一进行。同时做未加CAT片段的空白pQE-31载体质粒连接处理后的感受态细胞转化的对照。

 
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