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分子标记的种类及其发展
点击次数:1705 更新时间:2016-05-30

广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶(指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式)及等位酶(指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式)。狭义的分子标记概念只是指DNA标记,而这个界定现在被广泛采纳。本文中也将分子标记概念限定在DNA标记范畴。

1.2 理想的分子标记的界定

理想的分子标记必须达到以下几个要求:(1)具有高的多态性;(2)共显性遗传,即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型;(3)能明确辨别等位基因;(4)遍布整个基因组;(5)除特殊位点的标记外,要求分子标记均匀分布于整个基因组;(6)选择中性(即无基因多效性);(7)检测手段简单、快速(如实验程序易自动化);(8)开发成本和使用成本尽量低廉;(9)在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。

但是,目前发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求。

2 分子标记的种类

2.1 限制性片段长度多态性

2.1.1 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,缩写RFLP)是发展zui早的分子标记技术。RFLP技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点)和一段DNA的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化)等均可导致RFLP的产生。此技术及其从中发展出来的一些变型均包括以下基本步骤:DNA的提取、用限制性内切酶酶切DNA、用凝胶电泳分开DNA片段、把DNA片段转移到滤膜上、利用放射性标记的探针显示特定的DNA片段(通过southern杂交)、分析结果。由于线粒体和叶绿体DNA较小,前三个步骤就*可能检测出DNA片段的差异,所以往往不必要后面的几个步骤;对线粒体和叶绿体DNA进行的这种多态性差异检测在1980年之前就已出现,从理论上说,这种多态性也可称为RFLP。

2.1.2 一般选择单拷贝探针。但如果RFLP探针是来自拷贝数可变串联重复(Varible number of tandem repeats,缩写VNTR),则产生另一类因相同或相近序列的拷贝数变化所引起的多态性。凡是引起重复单位的大小和序列不同、基因组中重复的数目和分布不同等均可导致这种多态性的产生。在RFLP技术中有特殊用途(成为分子标记)的重复序列包括:(1) 小卫星(minisalite)序列:重复单位(motif)约有碱基10-60个(也有16-100个碱基一说),在基因组中多次出现。(2) 微卫星(microsalite)或简单重复序列(simple sequence repeats,缩写SSR):重复单位含有1-5个碱基(也有2-8个碱基一说)(microsalite一词由Litt & Luty(1989) 〔11〕提出)。

2.2以PCR(聚合酶链式反应)为基础的分子标记

2.2.1 随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,缩写RAPD):

2.2.1.1基本原理和特点:该技术用一个(有时用两个)随机引物(一般8-10个碱基)非定点地扩增DNA片段,然后用凝胶电泳分开扩增片段。其特点包括:(1)不需DNA探针,设计引物也不需要知道序列信息;(2)用一个引物就可扩增出许多片段(一般一个引物可扩增6-12条片段,但对某些材料可能不能产生扩增产物),总的来说RAPD在检测多态性时是一种相当快速的方法;(3)技术简单,RAPD分析不涉及Southern杂交、放射自显影或其它技术;(4)不象RFLP分析,RAPD分析只需少量DNA样品;(5)成本较低,因为随机引物可在公司买到,其价格不高;(6)RAPD标记一般是显性遗传(极少数是共显性遗传的),这样对扩增产物的记录就可记为“有/无”,但这也意味着不能鉴别杂合子和纯合子;(8)RAPD分析中存在的zui大问题是重复性不太高,因为在PCR反应中条件的变化会引起一些扩增产物的改变;但是,如果把条件标准化,还是可以获得重复结果的〔12〕;(9)由于存在共迁移问题,在不同个体中出现相同分子量的带后,并不能保证这些个体拥有同一条(同源)的片段;同时,在胶上看见的一条带也有可能包含了不同的扩增产物,因为所用的凝胶电泳类型(一般是琼脂糖凝胶电泳)只能分开不同大小的片段,而不能分开有不同碱基序列但有相同大小的片段。

 
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