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应用SDS提取法必须掌握的两个实验
点击次数:1591 更新时间:2016-09-05

SDS是一种阴离子去垢剂,化学名十二烷基苯磺酸钠,由于在高温条件下能裂解细胞并与细胞中多糖结合而被作为提取物质被广泛使用。SDS法提取主要应用于植物dna的提取和质粒提取,本文对这两个实验操作步骤进行讲解。

SDS法提取植物基因组DNA

本方法由Dellaporta,Wood和Hicks(1983)的方法修改而成。其基本原理是研磨的组织细胞用热的SDS裂解后,加入高浓度的KAc,0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质,zui后用乙醇或异丙醇沉淀。

一、材料试剂和仪器

1 材料 新鲜的组织材料或-80℃冻存的材料

2 试剂

(1)提取缓冲液

Tris-HCl 100mmol/L(pH8.0)

EDTA 50mmol/L (pH8.0)

NaCl 500 mmol/L

灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L

(2)裂解液20%SDS

(3)高盐溶液5mol/L KAc

(4) RNaseA 10mg/ml

(5) 异丙醇

(6)灭菌ddH2O或TE

3. 仪器: 离心机, 恒温水浴, 台式高速离心机,电泳装置

二、实验步骤

1取幼嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净,再用灭菌ddH2O冲洗2次,放入经液氮预冷的研钵中,加入液氮研磨至粉末状,用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500μL提取液的离心管中,轻轻混匀。

2 向管中加入50μL20%SDS溶液,混匀,不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂 ,65℃保温10min,并不时摇动。

3 加入150μL 5mol/L KAc,混匀,置冰上20-30 min。

4 4℃,15 000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中,加入0.7V的异丙醇,混匀,-20℃沉淀30 min 。

5 12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀,吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。

6 加入1/10体积的RNaseA,37℃保温20min,除去RNA。

7 CI抽提后,加2V乙醇,-20℃沉淀30 min 。12 000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。

8 用400μL 70%乙醇洗一次后,吹干,加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。

9 电泳检测完整性。

三、结果分析

1. 用紫外分光光度计在230nm、260nm、 280nm和310nm波长分别读数。其中260nm用琼脂糖凝胶电泳(0.8%)检测核DNA的完整性。完整性好的基因组DNA应是一条比23Kb滞后的电泳带, 若降解则成为弥散状。电泳前缘为未除干净的RNA。

2.如果DNA沉淀呈白色透明状而且溶解后成粘稠状,说明DNA含有较多的多糖类物质,可以在取材前将植物放暗处24hr,以达到去除淀粉的目的。

3. DNA沉淀呈棕色,难以酶切

植物材料含有大量酚类化合物,与DNA共价结合,使DNA呈棕色,并抑制DNA的酶解反应。为防止此情况出现,可在加入2 ×CTAB的同时加入2-5%的巯基乙醇,或者加入亚精胺(100μl DNA加5μl 0.1mol/L的亚精胺)。

4.DNA中含有多糖或盐类

将DNA用乙醇或异丙醇沉淀出来,离心,沉淀用70%乙醇清洗两次或更多次,吹干后重溶于TE中。(注意乙醇一定要吹干, 否则电泳点样时, 样品上漂)

5.DNA已降解电泳条带呈弥散状

样品降解可能有两种情况:一是机械振动过剧烈,二是操作过程中DNase污染。在提取DNA的各个操作过程中要避免剧烈振荡,提取液及用品要高温高压灭菌。另外,使用Tip头吸取过程中应避免产生气泡,Tip头应剪去Tip头尖,避免反复冻融DNA。

SDS裂解法提取大量质粒

本法的产量低得多,但却比其他方法更温和,是提取大质粒(大于15kb)的方法。

试验步骤:

1. 将500ml细菌沉淀物洗过后重悬于10ml用冰预冷的10%蔗糖、50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)溶液中,将悬液移至30ml的带盖螺口塑料试管中。

2. 加入2ml新配制的溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值小于8.0时,不能有效地发挥作用。

3. 加8ml 0.25mol/L EDTA(pH8.0), 将管倒置数次以混匀悬液,在冰上放置10min。

4. 加4ml 10% SDS,用玻棒迅速混匀内容物,使SDS均匀分散到整个细菌悬液中,操作应尽可能温和小心,以便zui大限度地避免释放出来的DNA受到剪切。

5. 立即加入6ml 5mol/L NaCl(终浓度为1mol/L), 再次用玻棒温和*地混匀内容物,在冰上放置至少1h。

6. 以4℃[用Beckman Ti50型转头(或与其相当的转头)],30 000rpm离心30min,小心将上清转移到一个50ml的一次性塑料离心管中,弃去沉淀物。如果细菌碎片未能全部除尽,可用35 000rpm再离心20min,将上清转移到另一管中,去掉存在离心管内的粘稠状液体。

8. 将水相转移到250ml的离心瓶中,于室温加入2倍体积的(约60ml )乙醇,充分混匀,室温下放置1-2h。

9. 以4℃,5000rpm离心20min,回收核酸。

10. 离心管倒置于纸巾上,使zui后残存的乙醇流干,在真空干燥内短时间干燥沉淀物,但不要使之*干燥。

11. 用3mlTE(pH8.0)溶解DNA。

zui后,大家要注意的是,植物基因组DNA提取中,各个操作步骤都要避免剧烈振荡,避免反复冻融DNA。SDS法是提取大于15kb的质粒方法,要注意在真空干燥沉淀物时,不能使其*干燥。

 
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