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掌握斑马鱼总RNA的提取实验方法
点击次数:749 更新时间:2016-09-07

分离纯净、完整的RNA对于分子克隆的实验是很重要的,而且是进行基因表达分析的基础。在总RNA中,75-85%为rRNA(主要是28S-26S/23S和18S/16S rRNA),其余的由分子量大小和核甘酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、snRNA及snoRNA等组成。mRNA一般只占总RNA的1%左右,而且由于RNA酶(核糖核酸酶,RNase)广泛存在、活性稳定,其反应也不需要辅助因子,因而在RNA的制备过程中只要存在少量的RNA酶就难以获得完整的RNA;而所制备的RNA的纯度和完整性又直接影响着RNA分析的结果,长度大于4kb的转录本本身存在的几率更小,其对于痕量RNase的降解也比小转录本更敏感,所以RNA的制备与分析操作难度,克隆长片段的基因更加是一门艺术。总之在所有RNA实验中,归根结底就是防止RNA酶的污染,分离到全长的RNA。

在实验中,一方面要zui大限度地抑制内源性的RNA酶。因为各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶,所以所有分离提取RNA的方案都是在能导致RNA酶变性或失活的化学环境中使RNA释放出来。另一方面要严格控制外源性RNA酶的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而为避免RNA酶的污染,实验中所用到的全部溶液、玻璃器皿、塑料制品等都需特别处理。

近年来,常用的RNA酶抑制剂主要有:(1)异硫氰酸胍。异硫氰酸胍是目前被认为zui有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。(2)焦碳酸二乙酯(DEPC)。是一种强烈但不*的RNA酶抑制剂。DEPC通过和RNA酶的活性基团的咪唑环反应而抑制酶活性,使用浓度为0.05-0.1‰。(3)钒氧核糖核苷复合物。由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,因而能地抑制RNA酶的活性。其使用浓度为10 mmol/L。(4)RNA酶的蛋白质抑制剂(RNasin)。是一种从大鼠肝或人胎盘中分离出来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶紧密结合形成复合物从而使其失活。(5)其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。本实验采用DEPC对实验中所用到的溶液、玻璃器皿和塑料制品等进行处理。

总RNA制备的方法很多,如1)异硫氰酸胍-法,许多公司有现成的总rna提取试剂盒(如Trizol试剂盒,其实质也是异硫氰酸胍-法),从而可快速有效地提取到高质量的总RNA。2)超离心方法,可以获得丰富且质量高的RNA。缺点是实验时间比较长,要求离心过夜。3)其它一些试剂盒,主要是利用某些特定的介质吸附RNA,驱除其它杂质以后,将纯净的RNA洗脱下来,这样就可以在短时间内获得纯净的RNA。但是价格比较昂贵。

目前,zui常用的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍/酸性酚的一步法。异硫氰酸胍-法的基本过程是:先将样品(以动物的腺体或组织为例)放进匀浆器中加入异硫氰酸胍变性液进行匀浆裂解,再用酸性(水饱和酚)、抽提除去DNA和变性的蛋白质,zui后用异丙醇沉淀出RNA。Trizol试剂法进一步提高了RNA的提取能力,可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。该法甚至可以从zui少100个细胞或1mg组织中提取RNA。本实验就简单介绍Gibcol公司的产品Trizol Reagent(Total RNA Isolation Reagent)的使用方法。不同公司的RNA提取试剂盒具体的使用方法略有不同,可参照产品使用说明书。

此外,不同组织中提取的RNA,其中残留痕量RNase污染的几率也不同,为了防止痕量RNase的污染,从富含RNase的样品(如胰脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA,在水中贮存一个星期就基本降解了,而从大鼠脾脏中提取的RNA,在水中保存3年仍保持稳定。为了增加贮存RNA样品的稳定性,可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中,存于-70℃(用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物)。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时,可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇,室温放置3-5分钟,10,000×g离心5分钟。

 
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