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细胞中的微丝染色及微丝与细胞形态的观察实验
点击次数:1411 更新时间:2017-02-06

【实验目的】 
掌握微丝的染色方法,了解光学显微镜和电子显微镜下微丝的基本形态结构。 
【实验用品】 
一、材料和标本 盖片培养的成纤维细胞三片。 
二、器材和仪器 光学显微镜一台、镊子一把、小平皿六个、载片三个、吸水纸、37℃恒温箱。 
三、试剂 PBS(pH7.2)、2%Triton X—100液、M—缓冲液、3%戊二醛固定液、0.2%考马斯亮兰染液、100μg/ml的细胞松驰素B、Dmem培养液。 
【实验内容】 
一、成纤维细胞微丝的染色及其对细胞松驰素B的反应 
(一)原理 
微丝普遍存在于多种细胞,对细胞的形状和运动有一定作用。细胞松驰素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合,从而破坏微丝,改变细胞的形状。 
(二)细胞松驰素B处理成纤维细胞与染色观察 
1.在平皿中有三张成纤维细胞贴壁生长的盖片,在超净工作台内将一张盖片移入另一皿中继续培养,用作对照。 
2.在有两片的平皿内加100μg/ml的细胞松弛素B 4滴继续培养半小时。 
3. 将用细胞松弛素B处理过的两张盖片取一张做染色处理,另一张用培养液洗五次(在平皿内换五次培养液,每次都要摇动),继续培养、观察。两小时后细胞形状恢复,接近正常。 
4.对恢复的盖片与*张没用药的盖片一同做染色处理。 
5.染色处理 
①将需染色的盖片放入盛有PBS的平皿内用吸管轻轻吹洗盖片,换液三次,每次3分钟,洗去培养液。 
②将盖片移入2%Triton X一100液,置37℃恒温箱内处理20~30分钟,以提取骨架以外的蛋白质,使骨架图像清晰。 
③立刻将盖片移入M一缓冲液,换洗三次,每次3分钟。M一缓冲液有稳定细胞骨架的作用。 
④将盖片移入3%戊二醛固定15分钟。 
⑤将盖片移入0.2%考马斯亮兰染液中,染色15分钟。然后小心地用自来水冲洗,空气干燥。 
(三)结果 
光镜观察,微丝聚集成的张力纤维束被染成蓝色。在没用药的标本上,成纤维细胞多数有突起,微丝沿突起规则排列;用细胞松驰素B处理的标本,由于微丝被破坏突起缩回,多数细胞形状变圆;用药处理后又洗去药的标本,由于解除了药的作用,肌动蛋白重新聚台形成微丝,细胞形状恢复正常。 
二、丽藻细胞内胞质环流及其对细胞松弛素B的反应 
(一)原理 
丽藻细胞大,整个细胞的为大液泡占据。靠近液泡是一层溶胶样流动的内质,在内质与质膜之间,为静止的外质,其中含有叶绿体。内质中含有许多颗粒,可以清楚地看到胞质环流。在丽藻细胞中的微丝与胞质环流有密切关系。成束的微丝出现在外质与内质接口(溶胶和凝胶接口)并交织一起,与环流方向平行。用细胞松弛素B处理后,就可抑制胞质的环流运动。 
(二)方法 
1.剪下一小块丽藻叶片(1~2cm),置于载片上,盖上盖片。 
2.观察(阳光充足时效果较好)。 
3.再取一块丽藻叶片,滴一滴细胞松弛素B,10~15分钟后盖上盖片,观察。 
4.洗去药物,再观察。 
(三)结果 
在丽藻内质中可以看到胞质环流,用细胞松弛素B处理后,胞质环流停止,洗去药物,又出现胞质环流。 
三、微丝的电镜照片观察 
恒河猴脊髓内神经纤维中微丝电镜照片,可见微丝是实心结构,直径5~8cm,它均匀地分散于细胞基质中,或排列成束和网状。

 
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