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神经细胞培养标准操作规程
点击次数:570 更新时间:2017-02-28

一. 设备: 无菌操作设备。
二. 大型设备CO2培养箱:恒温5%、10%CO2维持培养液中pH值。
倒置显微镜:用于每天观察贴壁细胞生长情况。
解剖显微镜,用于准确地取材。
常温冰箱:-4℃,用于保存各种培养液,解剖液和鼠尾胶。
低温冰箱:-20℃--80℃,用于储存血清酶,贵重物品和试剂。
电热干烤箱:用于消毒玻璃器皿。
高压消毒锅:用于消毒培养皿,手术器械。
过滤器:配制解剖液、培养液,必须过滤后才可使用,以去除细菌。
渗透压仪,pH剂,天平等。
三. 培养器皿及手术器械
1 培养皿:常用35mm塑料及玻璃皿,解剖取材用15mm-90mm直径。
2 培养板,24-40孔,可用于开放培养。
3 培养瓶:

准备:
一 配制培养液
(1) 解剖液:以无机盐(去除Ca2+ , Mg2+)加葡萄糖配制成PBS缓冲液,保持一定的渗透压和pH值。
(2) 基础培养基(MEM):主要为多种氨基酸,加入葡萄糖,双蒸馏水溶解。
(3) 接种培养液:用于消化后的细胞分散,做成细胞悬液,其成分为MEM含1%,另加入10%马血清,当天配制。
(4) 维持培养液:接种后24h,全部换成此液,后每2周换一次,每次换1/2。其成分为MEM中含5%马血清,1%,及适量的支持性营养物质。
二 培养基质 常用鼠尾胶、小牛皮胶,多聚赖氨酸,再涂胶
三消毒培养皿的备用。所有培养器皿均需清水冲洗2-3d,达两次ddH2O,每遍洗刷3-4次,加塞包装,置于烤箱中干燥消毒,于培养前1天进行。
神经细胞分散培养
(一) 选材 常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用胚龄6-8d,新生鼠或胎鼠(12-14d)或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以19d为宜,小鼠以18d为宜,大鼠纹状体以10d为宜;若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚,则黑质以13d,纹状体18-21d为宜;小脑以20-21d小鼠胚胎,所获蒲氏细胞成活率高,颗粒细胞正在分化;脊髓与DRG联合培养,常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎,取材易,神经成活率高。
(二) 取材。脑则取出相应组织,在解剖液中先剪碎,以使消化。脊髓则固定于琼脂板上,用小刀将其要成背腹两侧,分别培养。
(三) 细胞分离与接种。神经组织用0.125-0.25%在37℃孵育30min,移入接种液,停止消化,并洗去液,用细口吸管吹打细胞悬液,使其充分分散,如此多次,待沉淀后吸出上层细胞悬液,计数,预置细胞密度,接种于培养皿(1×106),做电生理应为5×105或更低。
(四) 抑制胶质细胞生长。培养3-5d后,也有人认为培养7d后,用阿糖胞苷,或5-FU抑制神经胶质细胞的生长。
(五) 观察。接种6-12h,开始贴壁,并有集合现象,细胞生长突起明显,5-7d胶质细胞增生明显,7-10d胶质细胞成片于神经细胞下面,形成地毯,2周时神经细胞生长zui,四周晕光明显,一个月后,有些神经细胞开始退化,变形,甚至出现空泡,一般培养2-4周zui宜。
但神经细胞只能增大,而不能增殖,只能原代,不能传代,不会有细胞周期,而且随培养时间的延长,细胞数量在下降,但胶质细胞可以,神经胶质细胞也可以。在培养过程中,早期9-12d时,有较多的神经细胞死亡,这是*次死亡阶段,应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多,且相互形成突触。
(六) 常用培养细胞实验有:FCM的蛋白总量分析;膜片钳与离子通道的分析;免疫组化分析;
但免疫组化分析应注意,由于抗体直接作用于活细胞,不易穿透活细胞,故对核内抗原定位时,首先考虑膜对抗体的通透性问题。常用化学试剂以增加其通透性或采用冰冻方法解决。
在免疫组化中,或其它组织学染色中,常用不同的染色方法以区分不同细胞,如半乳糖脑苷脂对小树突胶质细胞标记明显;GFAP对星形胶质细胞具有特异性染色等。这对研究神经系统中胶质细胞功能具有的应用价值。神经胶质细胞以往多被忽视,其在脑血管疾病(如缺血性损伤)、退行性疾病(如AD、PD)、损伤后胶质细胞的填充等具有不可忽视的作用。它也是神经细胞功能和营养支持的物质基础。

 
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