（二）材料

1. 生长成片的MDCK细胞

2. 无菌的T25细胞培养瓶

3. D-MEM培养液（含有L-）

4. 青、母液（10000 U/mLG；10000µg/mL硫酸），分装后保存于-20℃

5. HEPES缓冲液，1M母液

6. 胎牛血清

7. EDTA-（0.05%，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃

8. 7.5%牛血清白蛋白组分V

9. 1mL、10mL无菌移液管

10. 70％～75％的酒精

注意事项：经常检查试剂使用的有效期。

（三）实验步骤

这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。

1. D-MEM培养液的准备 
500mL D-MEM液中加入：
青、母液5mL（终浓度达：100U/mL；100µg/mL），
HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。 
7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL 
2. 细胞生长液的准备 
胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。 
3. 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-。 
4. 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA。 
5. 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-重复上述步骤。 
6. 加入1mLEDTA-使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的。 
7. 加9mL已经配置好的含有L-的D-MEM培养液，轻轻用移动移液管来吹散细胞团。 
8. 取10mL混合物加到90mL细胞生长液（细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞） 
9. 每个T25细胞培养瓶加入6mL（6×105/mL）细胞悬液，剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2～3日可生长成片（80％～90％）的单层细胞。 
10. 于37℃，5%CO2培养箱里培养细胞，每天观察细胞状态，以供进一步实验用。