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基因转染之磷酸钙-DNA共沉淀技术
点击次数:819 更新时间:2017-06-02

实验原理:核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时,可使DNA附在细胞表面,利于细胞吞入摄取,或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内,进入细胞的DNA仅有1%5%可以进入细胞核中,其中仅有不到1%DNA可以与细胞DNA整合,在细胞中进行稳定表达,基因转导的频率大约为10-4,这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是zui常用并的方法。

1、配液

(1)2×HBS 1.63g NaCl

1.19g Hepes

0.023g Na2PO42H2O

加水至100ml pH7.1过滤,4保存

(2)2mmol/L CaCl2 过滤除菌

(3)TE0.1mmol/L EDTA

1mmol/L Tris-HCL PH8.0

(4)G418(G418)液:1g G418溶于1mmol/L Hepes液中,加H2O10mL过滤除菌4保存。

(5)G418选择培养基:用含10%胎牛血清的Dmem培养液配制G418G418浓度为200 800mg/L

注意:对受体细胞先做预试验,选用浓度为在1014天内能杀死细胞50%以上的zui低浓度。

2、操作步骤[方法一]

(1)供体DNA制备:方法按前介绍的DNA提取法提取,溶于TE中,40mg/L

(2)受体细胞的培养:研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等,该细胞有一定自发转化倾向,一般在转染前一天接种细胞,接种密度为2×104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液,375%CO2培养,待细胞占5070%瓶底面积时,用于转染试验。

(3)DNA-磷酸钙沉淀物的制备

将供体细胞DNAPSV2-neo质粒载体DNATE配制成40mg/LDNA溶液,同时向供体细胞DNA200μl中加入带基因neo质粒DNA(20mg/L)220μl2×HBS 250μl(PSV2-neo12mg/L的使用量)

500μl上述DNA溶液加入硅化试管中,缓慢加入3.1ml2mol/L CaCl2混匀30秒。

然后立即混旋,室温下静置30分钟,待溶液轻度混浊后,吹打后即用于转染受体细胞。

(4)转染受体细胞

将处于对数生已占瓶底5070%的受体细胞,在转染前4小时更换一次新鲜培养基,每瓶5ml(25ml培养瓶)

吸取0.5mLDNA-磷酸钙沉淀,加入含5mL培养液的细胞瓶中摇匀。

37 5% CO2培养24h或更长,使细胞充分吸入DNA-磷酸钙结晶颗粒。

更换新鲜培养基,继续培养24小时,诱导转染基因的表达。

更换浓度800mg/LG418选择培养液进行筛选。同时设有未能转染的对照细胞。

培养大约35天,对照细胞大部分死亡,这时转染细胞更换浓度为200mg/LG418选择培养基,每34天更换一次选择培养基。

2周后对照细胞死亡,在转染的细胞瓶中可见有抗药性的细胞克隆出现,待其增大后再进行克隆化和扩大培养,可建立转化细胞株,并做进一步鉴定。

本实验要加入PSV2-neoDNA与外源DNA共转染受体细胞,这样可使受体细胞获得(neo)基因的抗药性,这样即使癌基因没有出现明显的转化灶,也可测出转入的外源性基因的抗neo的标记。而且还可利用被neo基因导入的受体细胞通过G418选择培养筛选转化的细胞建立细胞株。若以获取转化灶为目的,可不加入PSV2-neo DNA只需将从癌细胞中提取的基因组DNA导入受体细胞即可,其方法如下:

3、基因组DNA转染[方法二]

(1)配制磷酸转染液

NaCl 8.0g

Hepes 5.0g 用时现配,pH很重要一定要控制在6.95±0.65

Na2HPO4 0.099g 消毒灭菌 -20贮存备用

加温水至 1000mL

(2)按前面介绍的方法提取癌细胞基因组DNA

(3)取供体基因组DNA50100μg,3M NaCl或醋酸钠,使zui终浓度至0.3M混匀。

(4)再加2倍体积无水乙醇3000r/min离心10分钟,去上清。

(5)加入转染缓冲液,待DNA充分溶解后,再加入2.5MCaCl2,含zui终浓度为125mM,用吸管轻轻吹打三次(不用搅拌器以防DNA袢结),置室温下1030分钟,待液体透明度降低,出现微浊兰色时,即可用于转染细胞。 (6)取生长状态良好处于半汇合阶段的对数生细胞,在转染前4小时,更换培养液(5ml/)1次。

(7)转染:向每瓶中加DNA-磷酸钙沉淀物0.51mL/瓶,置37作用46小时。

(8)培养:弃去培养液,用15%甘油处理3分钟,无血清培养漂洗1次,接近汇合时血清用量降至5%,培养23周。

(9)检测:逐日观察,待出现转化灶后,克隆分离,扩大培养建立转化细胞株。

脂质体介导DNA转染法

脂质体(lipofectin regeant,LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-23-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下zui方便的转染方法之一。转染率高,优于磷酸钙法,比它高5100倍,能把DNARNA转染到各种细胞。

LR进行转染时,首先需优化转染条件,应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批LR都要做:*,先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间,DNA可从15μg和孵育时间6小时开始,按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线,再选用LRDNA两者的剂量,确定出转染时间(224小时)。因LR对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过24小时为宜。

细胞种类:COS-7BHKNIH3T3HelaJurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。

1、操作步骤[方法一]

(1)细胞培养:取6孔培养板(或用35mm培养皿),向每孔中加入2mL12×105个细胞培养液,37CO2培养至40%60%汇合时(汇合过分,转染后不利筛选细胞)

(2)转染液制备:在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液:用不含血清培养基稀释1-10μg DNA,终量100μLB液:用不含血清培养基稀释2-50μgLR,终量100μL,轻轻混合AB液,室温中置10-15分钟,稍后会出现微浊现象,但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LRDNA浓度过高所致,应酌情减量)

(3)转染准备:用2mL不含血清培养液漂洗两次,再加入1mL不含血清培养液。

(4)转染:把A/B复合物缓缓加入培养液中,摇匀,37温箱置624小时,吸除无血清转染液,换入正常培养液继续培养。

(5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。

注意:转染时切勿加血清,血清对转染效率有很大影响。

2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]

(1)5×105细胞/孔接种6孔板(35mm培养皿)培养24小时,使其达到5060%板底面积。

(2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下:

1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA

旋转1秒钟,再加入脂质体悬液,旋转。

室温下放置510分钟,使DNA结合在脂质体上。

(3)弃去细胞中的旧液,用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去,向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物,37培养35小时。

(4)再于每孔中加入20%FCSDMEM,继续培养1424小时,

(5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCSDMEM2mL/孔,再培养2448小时。

(6)用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定。

稳定的脂质体转染方法如下:

(1)接种细胞同前,细胞长至50%板底面积可用于转染。

(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)(3)步骤。

(3)在每孔中加入1mL20%FCSDMEM37培养48小时。

(4)吸出DMEM,用G418选择培养液稀释细胞,使细胞生长一定时间,筛选转染克隆,方法参照细胞克隆筛选法进行。

DEAE-葡聚糖转染法

DEAE-葡聚糖介导的转染,其原理还不清楚,可能是通过内吞噬作用而使DNA转导进入细胞核,此法只适合暂时转染实验,转染效率与DEAE-葡聚糖浓度以及细胞与DNA/DEAE-葡聚糖混合液接触时间的长短很有关系,可采用较高浓度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用较短时间(30分钟-1.5小时),又可用较低浓度(250g/L)DEAE-葡聚糖作用较长时间(8小时)

方法如下:

(1)接种鼠L成纤维细胞浓度为5×105CO2//皿生长23天,当达50%板底面积可用。

(2)乙醇沉淀的4μgPSV2-neo质粒DNA,空气干燥后溶于40μLTE中,或取供体DNA

(3)10ml 1×PBS4mL10%富合生长因子血清的DMEM洗板()

(4)80μl热的10g/L DEAE-葡聚糖中缓慢加入DNA,取120μL DNA/DEAE-葡聚糖加到每孔()细胞中,使其分布均匀轻轻转动直到显示均匀一致的红色,培养4小时。

(5)从孔()中吸出DNA/DEAE-葡聚糖,加入5mL 10%DMSD,室温放置1分钟,吸出DMSO,用5mL 1×PBS洗一次吸出,加入10mL培养液(10%血清的DMEM)

(6)培养细胞,在适当时间分析细胞,若含有抗药基因,可用G418选择培养液培养,方法同前。

 
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