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影响PCR的主要因素
点击次数:601 更新时间:2017-06-12

PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA,然后才进行自动热循环,zui后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行,临床应用只需购买pcr检测试剂盒就可开展工作,PCR自动热循环中影响因素很多,对不同的DNA样品,PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。
一、温度循环参数

在PCR自动热循环中,zui关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示,其变性、退火、延伸的条件是:94℃60s, 37℃60s, 72℃120s,共25~30个循环,扩增片段500bp。在这里,每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30~60s,这一迟滞时间的长短取决于几个因素,包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源(水浴或加热块)以及两步骤间的温度差,在设置热循环时应充分给以重视和考虑,对每一仪器均应进行实测。

关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离;距离越远,合成靶序列全长所需的时间也越长,前文给出的反应时间是按zui适于合成长度500bp的靶序列拟定的。下面就各种温度的选择作一介绍。

1.模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度,达不到变性温度就不会产生单链DNA模板,PCR也就不会启动。变性温度低则变性不*,DNA双链会很快复性,因而减少产量。一般取90~95℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种,时间过久没有必要;反之,在高温时间应尽量缩短,以保持Taq dna聚合酶的活力,加入Taq DNA聚合酶后zui高变性温度不宜超过95℃。

2.引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量;温度高特异性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,DNA扩增效率下降;温度低产量高,但过低可造成引物与模板错配,非特异性产物增加。一般先由37℃反应条件开始,设置一系列对照反应,以确定某一特定反应的zui适退火温度。也可根据引物的(G+C)%含量进行推测,把握试验的起始点,一般试验中退火温度Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低5℃,可按公式进行计算:

Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃

其中A,T,G,C分别表示相应碱基的个数。例如,20个碱基的引物,如果(G+C)%含量为50%时,则Ta的起点可设在55℃。在典型的引物浓度时(如0.2μmol/L),退火反应数秒即可完成,长时间退火没有必要。

3.引物延伸温度温度的选择取决于Taq DNA聚合酶的zui适温度。一般取70~75℃,在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达35~100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度,其速度取决于缓冲溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。扩增片段如短于150bp,则可省略延伸这一步,而成为双温循环,因Taq DNA聚合酶在退火温度下足以完成短序列的合成。对于100~300bp之间的短序列片段,采用快速、简便的双温循环是行之有效的。此时,引物延伸温度与退火温度相同。对于1kb以上的dna片段,可根据片段长度将延伸时间控制在1~7min,与此同时,在PCR缓冲液中需加入明胶或BSA试剂,使Taq DNA聚合酶在长时间内保持良好的活性与稳定性;15%~20%的甘油有助于扩增2.5kb左右或较长DNA片段。

4.循环次数常规PCR一般为25~40个周期。一般的错误是循环次数过多,非特异性背景严重,复杂度增加。当然循环反应的次数太少,则产率偏低。所以,在保证产物得率前提下,应尽量减少循环次数。

扩增结束后,样品冷却并置4℃保存。

二、引物引物设计

要扩增模板DNA,首先要设计两条寡核苷酸引物,所谓引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段,两引物间距离决定扩增片段的长度,两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。由此可见,引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键,引物设计也就更为重要。

引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序列必须是已知的,两引物之间的序列未必清楚,这两段已知序列一般为15~20个碱基,可以用DNA合成仪合成与其对应互补的二条引物,除此之外,引物设计一般遵循的原则包括:

 
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