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PCR产物克隆方法
点击次数:696 更新时间:2017-06-20

通常情况下,PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接,但其连接效 率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性,能 在两6DNA链的3"末端加上一个多余的碱基,使合成的PCR产物成为 3"突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR 产物的效率通过较高,。在采用大量T4dna连接酶并配以5—10u T4 RNA连接酶时,可显著提高其连接效率。对于较短PCR产物,用PUS19 Hinc位点进行克隆,以XgalIPTG筛选,常可得到足量重组 子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶 消去3"末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA,然后再用平端连接法 克隆PCR产物。

粘端连接

引物中设计入限制酶位点:由于PCR引物的5"末端可以增加一些非 互补碱基,因此可以在两引物的5"末端设计单限制酶或双限制酶切 位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端,即可与有互 补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高,且当两引物中设计 不同酶切位点时,可有效地定向克隆PCR产物。其缺点是需要加长 PCR引物,除限制酶识别序列外,还需要在其5"端多合成3—4个碱基 以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合。即使如此,其酶切 效率也不够高。其中尤以NotIXhoIXbaI等较为难切。采用突变 PCR方法可克服上述缺点。该方法是通过在两PCR引物序列中改变1 数个核苷酸创造出一个限制性内切酶位点。鉴于PCR引物的3"末端序 列的互补性是PCR成功的关键,在PCR引物的中部或近5"端改变1个或 几个碱基对PCR扩增效果影响不大。这种方法不需要增加PCR引物的 长度,而且酶切效果优于5"加端法。对于特定DNA

段的克隆,此方 法较为经济、实用。但对于基因诊断PCR产物的克隆,似乎5"加端法 更为适宜。

T4DNA聚合回切产生粘端

PCR两引物的5"末端是AT,则可在 5"端分别加上CGCCGG。用此二引物扩增的PCR产物在dATPdTTP 存在的情况下,用T4dna聚合酶进行处理,则T4DNA聚合酶因具有3"→ 5"外切酶活性而消去3"末端的GC,产生AccIXmaI粘性末端(图1)。 DNA段直接与用AccIXmaI切开的载体进行连接。这种方法只需 PCR引物的5"端加2—4个碱基,但其可选择的限制酶类有限。

Tvector

TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA3"末端加一个碱 基,所加碱基几乎全是腺苷。据此,Marchuk等人采用3"端突出一个 胸苷的质粒dna来克隆PCR产物,其克隆效率比平端的连接至少高出 100倍。他们用EcoRVpBluescript切成平端,然后在2mmol/LdTTP 存在下,用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的两个3"末端各加一处胸 苷。因为在4dNTP都存在时,Taq聚合酶选择性参入dATP,而当仅 一种dNTP存在时,它只能参入该种碱基。因此,在只加入ddTTP时, TaqDNA聚合酶可使平端载体DNA转变成3"末端突出一个胸苷的T 载体,称为Tvector。用这种Tvectorsk可以较有效地直接克隆 PCR产物。Hotton等人也报道了另一种制备Tvector的方法。他们 使用脱氧核苷酸末端转移酶在切成平端的载体DNA3"末端加上一个 胸苷。由于末端转移酶可以催化多个碱基(ddTTP)作为底物,使平 端载体DNA分子的两个3"末端各加上一个T。用这种方法制备的Tvector 的不同之处在于前者3"末端不能与待克隆PCR产物的5"末端连接,仅 5"末端可与PCR产物的3"末端形成磷酸二脂键。

共环消解法:zui近,Jung等人报道了一种有效的PCR产物克隆方 法。用磷酸化的PCR引物扩增得到的PCR产物,先用T4DNA连接酶催化 连接反应,使5"端带有限制酶切位点的扩增DNA段连接成共环结 构。然后再用相应的限制酶进行消化,产生粘端DNA段。对于对称 性限制酶位点,只需在引蛾的5"末端加上一关识别序列,因为在串 接成共环后能恢复限制酶切位点难于切开的缺点,且可用于双限制 酶切位点的设计,只不过有PCR产物共环化后,仅约1/4的限制酶切 点得以恢复。故此法较适用于单限制酶位点的克隆。

 
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