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Southern 杂交鉴定
点击次数:669 更新时间:2017-06-22

1 10ul待测DNA,于一定浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳。(20mL,1.0%凝胶,)
2) 凝胶用溴化乙锭染色,切掉凝胶四周多余部分,并在凝胶的一角作一记号, 拍照
记录电泳结果(拍照时, 凝胶旁放一尺子)
3) 杂交用胶的制备 (做以下步骤两组合一)
A 将凝胶浸没入30mL 0.25mol/L HCl溶液中15min,使DNA脱嘌呤。
B.用蒸馏水短暂洗凝胶2次。
C.将凝胶浸没入30mL变性液中30min, 使凝胶变性。
D.将凝胶浸没入30mL中和液中15min使它被中和。
重复D一次。在制备杂交用胶时准备转移的平台、膜、滤纸等(45)
4) 准备DNA从凝胶向膜转移的平台
5) 1张待用尼龙膜和3张厚滤纸切成与待转移胶相同大小,并在尼龙膜一角做一标记。
1张厚滤纸切成与凝胶相同宽度,长度(18cm)足以达到转移液盒子的底部。
准备10 X SSC 转移液。
将待用尼龙膜用蒸馏水浸湿后,再浸入10 X SSC 转移液中。
6)安装毛细管转移装置
A.将长的滤纸放在转移平台的顶部,滤纸两端达到转移盒的底部,做成虹吸桥。
B.将8 0mL转移液倒入转移盒内,并湿润滤纸。
C.将凝胶背面朝上置于滤纸搭成的桥上,凝胶与滤纸间避免有气泡。
D.用保鲜纸封住凝胶四边。
E.将浸湿的转移膜置于凝胶的上部,凝胶与膜间避免有气泡。
F.将剩下的3张滤纸小心的放在转移膜的上面,并放一叠吸水纸搭在滤纸上,再放一
玻璃板,其上压一重物。
G.转移几小时或过夜(至少4小时)
注意:勿使转移液干枯。
7)已转移的DNA与膜交联
A.将膜放在浸有10 X SSC的厚滤纸上,有DNA的一面朝上。
B.将膜置于UV crosslinker 中,在紫外光下自动交联。
C.用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜,空气中干燥。
此膜可在4oC保存。
8)DNA探针的制备(略过)
参照生产商提供的实验方法合成地标记的探针。
9)印迹的预杂交
将适量的预杂交液DIG Easy Hyb42 oC预热。
放入印迹膜,42 oC预杂交30min
10)准备探针
水煮地标记的探针5min使变性, 并立即放在冰上2min.
11) 加适量的探针到已预热的杂交液中,混合均匀(避免形成泡沫,影响杂交效果)
42 oC杂交至少4小时或过夜。
注意: 不要将探针直接加在印迹膜上,而应加在容器一角的预杂交液中
12)印迹膜的冲洗:
A.将杂交液倒出,储存起来可再次使用。
B 25mL2 X SSC,0.1% SDS 在室温摇动洗膜2,每次5min .
C 用已预热的30mL 0.5XSSC,0.1%SDS 65 oC摇动洗膜2,每次15min (用杂交炉).
13)免疫检测:
A. 10mL冲洗液洗膜1-5min.
B. 膜在15mL阻断液中孵育30min 
C. 膜和8mL抗体孵育30min
D. 15mL冲洗液中洗膜2,每次15min.
E. 15mL检测液中平衡2-5min. 
14)将膜的有DNA的面朝上,放在保鲜纸上,滴数滴CSPD ready-to-use 覆盖膜; 然后,立即
用保鲜纸包裹, 挤掉多余的CSPD ready-to-use,使其均匀平铺在膜上,没有气泡, 但避 
免使膜干掉. 室温孵育5min.
15)37 oC孵育潮湿的膜10min,增强发光.
16)X-光底片将杂交膜进行曝光10-25min.
(发光性能至少可持续48小时)
17) X-光底片的冲洗
Agfa 30显影液显影(1-5min)---冲水(1min)---F5定影液定影(10min)---用水冲洗---晾干底片

 
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