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RNA干扰技术介绍
点击次数:496 更新时间:2017-07-04

1995年,康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫(C. elegans)中的par-1基因时,发现了一个意想不到的现象。她们本是利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达,而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA(sense RNA)以期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反的。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。
直到1998年2月,华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学医学院的Craig Mello才揭开这个悬疑之谜。通过 大量艰苦的工作,他们证实,Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象,以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断,都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现,基因抑制效应变得十分微弱,而经过纯化的双链RNA却正好相反,能够特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA干扰(RNA interference ,简称RNAi)。

在随后的短短一年中,RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入,RNAi的机制正在被逐步阐明,而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具,RNAi也越来越为人们所重视。

RNA干扰技术[RNA interference,RNAi]
RNAi的作用机制RNAi作用机制图解(以线虫中的三种不同形式为例)

体外实验表明:RNAi反应中,加入的dsRNA被切割为21-23核苷酸长的RNA片段,后者会使目的mRNA被切割为21-23核苷酸长的片段。从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中,Hammond等人部分纯化了一种核酸酶,该核酸酶具有序列特异性,它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些不该呢?由于在纯化该核酸酶时,可以共分离出21-23核苷酸长的 dsRNA 片段,这暗示该核酸酶对mRNA的切割有可能是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验结果,人们提出一种RNAi作用的简单模型。当dsRNA导入细胞后,被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别,切割成21-23核苷酸长的小片段,这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合,并且作为模板识别目的mRNA;识别之后,mRNA与dsRNA的有义链发生链互换,原先dsRNA中的有义链被mRNA代替,从酶-dsRNA复合物中释放出来,而mRNA则处于原先的有义链的位置。核酸酶在同样位置对mRNA进行切割,这样又产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段,与核酸酶形成复合物,继续对目的mRNA进行切割,从而使目的基因沉默,产生RNAi现象。通过遗传分析的方法,目前已从线虫中已分离到RDE-2,RDE-3和Mut-7等RNAi相关的基因。

 
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