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士锋生物:RNA的制备
点击次数:421 更新时间:2017-07-10

一、mRNA的分离 
与rRNA和tRNA不同的是,哺乳动物细胞的绝大部分mRNA在其3’端均有一poly(A)尾,因此可以用oligo(dT)-纤维素亲和层析法从大量的细胞RNA中分离mRNA。在构建cdna文库时, 必须经上述纯化步骤制备mRNA模板。进行Northern杂交或Sl 核酸酶作用图分析时,与总RNA相比,采用poly(A)+ RNA能获得更为满意的结果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制备Oligo(dT)-纤维素,也可以买现成的产品。 
1)用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g 0ligo(dT)-纤维素。 
2)将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱或装入填有经用DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴期德吸管中, 柱床体积为0.5-1.0ml,用3倍柱床体积灭菌水冲洗柱床。柱床体积为1m的oligo(dT)-纤维素zui大量为10mg总RNA,如果总RNA的量较少,则应减少oligo(dT)-纤维素的使用量以防止poly(A)+RNA在过柱以及后续步骤中损失。 
3)用无菌的1x层析柱加样缓冲液冲洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x层析柱加样缓冲液 
20mmol/L Tris.Cl(pH7.6) 
0.5mol/L NaCl 
1mmol/L EDTA(pH8.0) 
0.1%SDS 
可按以下方法制备灭菌的层析柱加样缓冲液;将适量无rna酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化钠和EDTA贮存液混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高压下蒸气灭菌,待其次序却至65℃左右时加入已在65℃预热30分钟的10 %SDS贮存液。也可以用0.05mol/L柠檬酸钠代替Tris.Cl 然后用DEPC处理柠檬钠-NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。 
4)用灭菌水溶解RNA,于65℃温育5分钟后使迅速冷却至室温,加等体积的2x层析柱加样缓冲液,上样,立即用灭菌的试管收集洗液。 当所的RNA溶液均进入柱床后,加1倍体积的1x层析柱加样 ,继续收集洗出液。加热RNA可以破坏可能涉及poly(A)尾的二级结构。 
5)当全部溶液流出后,将收集液置于65℃温育5分钟,重新上样,并收集流出液。 
6)用5-10倍柱床体积的1x层析柱加样缓冲液洗柱,分部收集洗出液,测定每一收集管的OD260。zui补由于不带poly)A)的RNA洗过柱床, OD260会很高,后来OD260值则很小或为零。在某些方案中,上述步骤后还用5倍柱术体积的含0.1mol/L NaCl的1x 层析柱加样缓冲液洗柱床,然而由于洗出的不带poly(A)的RNA很少甚至没有, 因此这一步骤可以省略。 
7)用2-3倍柱床体积的经灭菌且无RNA酶的洗脱缓冲液洗脱mRNA,以1/3-1/2柱床体积分部收集洗脱液。洗脱缓冲液 
10mmol/L Tris.Cl(pH7.6) 
1mmol/L EDTA(pH8.0) 
0.05%SDS

 
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