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PCR的相关技术介绍
点击次数:557 更新时间:2017-08-16

一、聚合酶链反应的历史回顾

1、核酸体外扩增zui早的设想

由Khorana及其同事于1971年提出:“经过DNA变 性,与合适引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重视该过程便可克隆tRNA基 因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物,且当时(1970年)Smith等发现了 DNA限制性内切酶,使体外克隆基因成为可能,所以,使Khorana等的早期设想被人 们遗忘。

2、聚合酶链反应的发明

1985年,美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室 Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR), 使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。其原理类似于DNA的体内 复制,只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件。开始是使用大肠杆菌 dna聚合酶Klenow片段来扩增人基因组中的特异片段。由于该酶不耐热,因此,每次 加热变性DNA后都要重新补加Klenow酶。在操作多份标本时,这一过程耗时,费力, 且易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得PCR反应更易于自动化,继而PE-Cetus公司推 出了*台PCR热循环仪,使该技术的自动化成为现实。Mullis等因此项技术于1993年 获得诺贝尔奖金。

二、聚合酶链反应相关技术的发展

PCR及其相关技术的发展速度是惊人的。上分别于1988年和1990年在美国和 英国召开了*届和第二届PCR技术专题研讨会。*届会议主要讨论了PCR的应用 与技术本身的优化问题;第二届会议的主要议题是人类基因组计划与PCR的进 展。这充分体现了生物学家对PCR的重视。

(表)聚合酶链反应的相关技术

名 称

主要用途

简并引物扩增法

扩增未知基因片段
巢居PCR

提高PCR敏感性、特异性,分析突变
复合PCR

同时检测多个突变或病原
反向PCR

扩增已知序列两侧的未知序列,致产物突变
单一特异引物PCR

扩增未知基因组DNA
单侧引物PCR

通过已知序列扩增未知cDNA
锚定PCR

分析具备不同末端的序列
增效PCR

减少引物二聚体,提高PCR特异性
固着PCR

有利于产物的分离
膜结合PCR

去除污染的杂质或PCR产物残留
表达盒PCR

产生合成或突变蛋白质的DNA片段
连接介导PCR

DNA甲基化分析、突变和克隆等
RACE-PCR

扩增cDNA末端
定量PCR

定量mRNA或染色体基因
原位PCR

研究表达基因的细胞比例等
臆断PCR

鉴定细菌或遗传作用
通用引物PCR

扩增相关基因或检测相关病原
信使扩增表型分型(mapping)

同时分析少量细胞的mRNA
三、其它扩增技术

与PCR及其相关技术发展的同时,新的扩增技术也不断诞生。这些技术各有利 弊,与PCR互为补充,有的可结合应用,共同构成了核酸体外扩增技术的大家族。我 们相信,随着分子生物学技术的发展,这一家族一定会再涌现出新成员。

其它体外核酸扩增技术(表)

技术

应用

转录依赖的扩增系统(TAS)

检测HIV

连接酶链反应(LCR)

检测点突变

自主序列复制(3SR)系统

研究RNA,临床应用、法医学等

链替代扩增(SDA)

检测、鉴定基因

Qβ复制酶系统

增加探针检测敏感性

循环探针反应

增加探针检测敏感性

 
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